标题：
Investigation of MSC Potency Metrics via Integration of Imaging Modalities with Lipidomic Characterization
通过整合多种方法探究 MSC 功能评价指标的研究
期刊名称与出版年份：
Cell Reports, 2024
第一作者与通讯作者：
Priyanka Priyadarshani, Luke J. Mortensen
第一单位：
School of Chemical, Materials, and Biomedical Engineering, University of Georgia, Athens, GA, USA
摘要：
本研究在单细胞水平分析了 MSC 的形态学和脂质组学特征，并阐明这些特征能够区分由免疫刺激诱导的功能性 MSC 亚群。研究者使用 DPC 显微镜和 MALDI-MSI 技术，探索了形态变化与特定脂质类别活化之间的关联，结果表明这有助于优化 MSC 的制造工艺。
背景：
由于间充质干细胞 (MSC) 具有免疫抑制作用，因此在再生医学中具有广阔前景；然而，其效果会因供体不同以及细胞增殖阶段不同而存在差异。本研究旨在通过对 MSC 的形态与脂质组学特征进行整合评价，理解单细胞水平的功能异质性，并以改善临床应用为目标。
方法：
研究者使用无标记差分相位对比（DPC）显微镜和 MALDI-MSI，同时获取 MSC 的形态和脂质组学特征，并在受 IFN-γ 刺激的 MSC 与未处理的对照之间比较形态和脂质组学的变化。
结果：
在受 IFN-γ 刺激的 MSC 中，观察到特定形态特征（例如：紧凑度、周长、主轴长度等）与脂质（尤其是 PC、LysoPC、TAG 等）之间存在强相关性。这些特征可作为识别 MSC 功能性亚群的指标。
讨论：
本研究表明，MSC 的形态与脂质组学有望用于识别功能性亚群。由此有望改善再生医学中 MSC 的制造工艺。
与既往研究相比的新颖性：
本研究在单细胞水平对形态与脂质组学进行了整合分析，并表明这是阐明 MSC 功能异质性的一种新方法。
局限性：
由于单细胞脂质组学的信号较低，可检测脂质的数量受到限制，这是本研究的局限性。此外，由于需要大规模数据集，因此还需要今后的进一步研究。
应用潜力：
该方法有望应用于识别 MSC 的功能性亚群以及优化制造工艺。
补充信息：
使用 Readable，可以在保持论文 PDF 排版的同时将其翻译成其他语言。它也是 Paper Interpreter 制作者 Daichi Konno 所喜爱的服务。输入优惠码 “PaperInterpreter” 即可享受一个月的免费试用，敬请尝试 😊
Q&A:
Q: 是如何分析单细胞脂质的？
A: 单细胞脂质分析采用了以下方法。
- MALDI-MSI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging)：
利用 MALDI-MSI 技术，在单细胞水平获取 MSC 的脂质特征。在该技术中，将 MSC 接种于氧化铟锡（ITO）涂层载玻片上，并将受 IFN-γ 刺激的组与未处理的对照组进行比较。在 MALDI-MSI 中，从光谱数据中提取与特定 m/z 值相对应的脂质峰，并将其成像。 - 共配准 (Co-registration)：
将 DPC 显微镜获得的形态图像与 MALDI-MSI 获得的脂质图像整合，并进行共配准，以将每个细胞的形态与脂质特征相关联。在此过程中，对形态特征与脂质峰进行了匹配。 - 统计分析：
为了在所获得的脂质特征中鉴定差异表达的脂质，进行了主成分分析（PCA）和逻辑回归分析。此外，为了对光谱进行精确的质量鉴定，还使用了高分辨率傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）以及超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）。
通过这种方法，阐明了在单细胞水平上由 IFN-γ 刺激引起的 MSC 脂质特征的变化。
Q: 什么是 MALDI-MSI？
A: MALDI-MSI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging) 是一种利用质谱仪可视化生物样本空间分布的技术。具体而言，按以下步骤进行。
- 样本制备：
将样本（通常为薄切片的组织或细胞）放置在特殊基板（例如：氧化铟锡涂层载玻片）上。接下来，将一种称为基质的化合物均匀涂覆于样本表面。该基质起到使其更易于吸收激光能量的作用。 - 激光照射：
样本上的基质受到激光照射，其能量使离子从样本表面释放出来。此过程称为”解吸（desorption）”。 - 电离：
释放出的分子被电离，进入可被质谱仪检测的状态。这称为”电离（ionization）”。 - 质量分析：
电离后的分子被导入质谱仪，根据质荷比（m/z）进行分离并被检测。由此获得样本中各种化合物的质谱。 - 成像：
在 MALDI-MSI 中，于样本上的各个位置获取质谱，并基于这些数据将化合物的空间分布成像。由此可以直观地确认特定分子种类在样本内的分布情况。
MALDI-MSI 被广泛用于详细分析生物组织和细胞的结构及化学性质，尤其适合于揭示脂质和蛋白质等分子的空间分布。
Q: 鉴定出了多少种脂质？
A: 通过 MALDI-MSI 分析，共鉴定出 54 种特定的脂质峰。其中，在受 IFN-γ 刺激的 MSC 与未处理的对照细胞之间，有 20 种脂质在受 IFN-γ 刺激的细胞中显著较多，有 6 种脂质在对照细胞中显著较多。其余 26 种脂质在两组之间未见显著变化。
Q: 54 种算少吗？
A: 在单细胞水平的 MALDI-MSI 分析中，54 种脂质一般来说并不算少，但根据技术进步和分析条件，也有可能鉴定出更多的脂质。
在 MALDI-MSI 的单细胞分析中，由于质谱的信号强度较低，可检测的脂质数量有时会受到限制。尤其在单细胞分析中，由于从样本中获得的物质量非常少，因此要鉴定出更多脂质需要高灵敏度的测量。
因此，54 种这一数字在单细胞 MALDI-MSI 分析中被认为是合理的数量，但随着今后技术的进展以及与其他互补分析方法（例如：超高效液相色谱-串联质谱 (UHPLC-MS/MS)）的结合，有可能鉴定出更多的脂质。
Q: 为什么用 IFN-γ 进行刺激？
A: 使用 IFN-γ（干扰素 γ）进行刺激的原因是为了研究 MSC（间充质干/基质细胞）的免疫应答性。具体而言，有以下原因。
- 促进免疫应答：
IFN-γ 是在免疫系统中发挥重要作用的细胞因子，对包括 MSC 在内的多种细胞具有强烈的刺激效应。通过用 IFN-γ 刺激 MSC，可使 MSC 更易于发挥免疫抑制性和免疫调节性功能，并能够详细研究此时细胞的应答和变化。 - 阐明功能异质性：
MSC 可能会根据供体和培养条件表现出不同的免疫应答。通过用 IFN-γ 刺激，可以观察与 MSC 免疫抑制功能相关的脂质和形态的变化，并阐明不同亚群之间的功能差异。 - 改善临床应用：
用 IFN-γ 对 MSC 进行”预激（priming，即预处理）“被用作提高临床治疗效果的策略。理解细胞对刺激的应答，有助于 MSC 的质量控制和制造工艺的优化。
如此，使用 IFN-γ 进行刺激是评价 MSC 免疫应答性、并在提高 MSC 于再生医学和免疫疗法中疗效的研究中的重要步骤。
Q: 具体增加了哪些脂质？
A: 在受 IFN-γ 刺激的 MSC 中，确认以下脂质有所增加。
- Ceramide-1-phosphate (C1P)：
- m/z 688.4: CerP 33:2;O6
- Phosphatidylcholine (PC)：
- m/z 758.6 [M+H]+/780.5 [M+Na]+: PC (34:2)
- m/z 732.6: PC (32:1)
- m/z 804.6: PC (36:4)
- m/z 504.3: PC (16:0/18:1)
- Lysophosphatidylcholine (LysoPC)：
- m/z 546.3: LysoPC(18:0)
- Triglyceride (TAG)：
- m/z 789.6: TG 43:1;O2
这些脂质在受 IFN-γ 刺激的 MSC 中发挥着与免疫功能和细胞膜结构相关的作用，并已确认尤其在免疫应答性增强时会增加。这些脂质的增加被认为会影响 MSC 的免疫抑制功能和细胞形态。
Q: 这些脂质与免疫应答的关联是什么？
A: 在受 IFN-γ 刺激的 MSC 中增加的脂质包括那些在免疫应答中发挥重要作用的脂质。以下说明每种脂质在免疫应答中的关联性。
- Ceramide-1-phosphate (C1P)：
- 作用： C1P 参与鞘脂的代谢，具有抗凋亡（抑制细胞死亡）作用，同时在调节细胞迁移和炎症应答方面发挥重要作用。已知它能促进免疫细胞的活化和迁移，并调节炎症反应。
- Phosphatidylcholine (PC)：
- 作用： PC 是细胞膜的主要组成成分，通过形成脂筏（lipid raft），对于免疫调节性细胞因子的分泌以及启动受体介导的免疫应答十分重要。PC 的代谢产物参与免疫细胞的信号传导以及细胞的分化和增殖。
- Lysophosphatidylcholine (LysoPC)：
- 作用： LysoPC 参与细胞膜的重塑和细胞信号传导，并影响炎症应答和免疫细胞的功能。已知 LysoPC 能调节基因表达，促进细胞的增殖和分化。此外，LysoPC 有时会诱导炎性细胞因子的产生。
- Triglyceride (TAG)：
- 作用： TAG 作为能量来源十分重要，其代谢产物脂肪酸和甘油是免疫细胞分化和功能所必需的。TAG 的代谢产物参与细胞膜磷脂的合成以及免疫细胞的信号传导通路。
Q: 这些脂质是如何影响免疫细胞的？是脂质被摄取吗？还是刺激受体？
A: 这些脂质通过多种机制影响免疫细胞。以下说明各脂质对免疫细胞产生影响的具体机制。
- 脂质的释放与受体刺激：
MSC 分泌的脂质主要通过称为外泌体和微囊泡的小型细胞外囊泡 (EV) 释放。这些囊泡中含有脂质、蛋白质、RNA 等，能够与其他细胞相互作用。
- 外泌体的释放： MSC 释放外泌体，其中含有脂质。当外泌体被免疫细胞摄取时，内部的脂质及其他成分可能会直接影响细胞内部。
- 受体刺激： 特定脂质（例如 LysoPC 和 PC）与免疫细胞表面存在的受体结合并启动信号传导。例如，LysoPC 通过 G 蛋白偶联受体（GPCR）向免疫细胞传递信号，诱导细胞迁移（chemotaxis）和细胞因子的分泌。此外，PC 能促进脂筏的形成，帮助受体的聚集和活化。
- 脂质的直接摄取：
从 MSC 释放出的脂质有时也会被免疫细胞直接摄取。这种摄取包括脂质作为细胞膜的一部分被整合、或被用作能量来源等过程。
- 通过内吞作用的摄取： 免疫细胞通过内吞作用摄取从 MSC 释放出的脂质。被摄取的脂质用于细胞膜的重组和能量代谢，有助于细胞的活化和功能变化。
- 膜整合与信号传导： 当脂质被整合到免疫细胞的膜中时，会影响膜的物理特性和信号传导通路。由此，免疫细胞的敏感性和反应性发生变化，有时会诱导特定的免疫应答。
- 信号传导的间接变化：
脂质的影响有时也会通过免疫细胞内外信号传导的变化间接发挥。
- 信号分子的生成： 脂质在代谢过程中生成的信号分子（例如：二酰甘油、前列腺素）会调节免疫细胞的信号传导，改变细胞的功能。
- 炎性细胞因子的诱导： 部分脂质会激活免疫细胞内部的信号传导级联，促进炎性细胞因子的产生。由此促进其他免疫细胞的活化和动员，强化整体的免疫应答。
Q: 是否可以理解为脂质是由 MSC 分泌的？
A: 不是，前述的说明有一些容易引起误解的地方。脂质确实有时会以外泌体或囊泡的形式从 MSC 分泌出来，但本次研究所提及的脂质，主要是作为 MSC 自身的细胞膜或内部代谢物发挥功能的。
准确的理解：
本研究中脂质的作用主要与 MSC 自身的功能和形态相关。具体而言，认为 MSC 通过以下过程影响免疫应答。
- MSC 的细胞膜组成与功能的变化：
- 脂筏的形成： MSC 细胞膜中存在的脂质（如 PC 和 LysoPC）会形成称为脂筏的膜内区域，从而促进免疫受体的排布和聚集。这种排布的变化会在 MSC 与免疫细胞接触时，诱导免疫细胞的活化或抑制。
- 膜流动性与结构的变化： 当 MSC 的膜脂质组成发生变化时，细胞膜的物理特性（例如：流动性、柔韧性）会改变，这会影响 MSC 的免疫调节功能。
- MSC 分泌物质的调整：
- 细胞因子和生长因子的分泌： 当脂质代谢在 MSC 内受到调节时，会影响 MSC 所分泌的细胞因子和生长因子的种类和数量。这些分泌物直接或间接作用于免疫细胞，调节免疫应答。
- MSC 与免疫细胞的直接相互作用：
- 通过细胞接触的信号传导： 当 MSC 与免疫细胞直接接触时，MSC 的膜脂质发挥调节对免疫细胞信号传导的作用。由此引起免疫细胞的活化、分化或抑制。
总结：
本研究中脂质的作用是：MSC 利用自身细胞膜及内部的脂质来诱导与免疫功能相关的变化，而这最终会影响 MSC 对免疫细胞所表现出的免疫调节功能。因此，这些脂质主要影响 MSC 自身的功能，并在 MSC 与免疫细胞相互作用时发挥重要作用。