El «potenciador» de las vacunas de ARNm no era el contenido, sino el envase: el lípido ionizable golpea TLR4 y pone en marcha la inmunidad innata

Las vacunas suelen llevar un adyuvante (adjuvant, potenciador de la respuesta inmunitaria). Como el antígeno por sí solo no consigue que el sistema inmunitario se lo tome en serio, se le añade una sustancia que avisa a la inmunidad innata de que «aquí ha llegado algo extraño». Se emplean sales de aluminio o moléculas que imitan componentes bacterianos.

Pero las vacunas de ARNm no llevan adyuvante. En la lista de componentes solo hay ARNm y lípidos. Y, aun así, generan anticuerpos potentes e inmunidad celular. Es decir, esta vacuna lleva escondida en algún lugar de sí misma la función de un adyuvante.

¿Dónde está?

Lo primero que viene a la cabeza es el ARNm, porque el ARN es, de por sí, una molécula que se detecta como algo ajeno. Pero resulta que ocurre lo contrario: el ARNm de las vacunas actuales lleva una modificación llamada N1-metilpseudouridina que lo hace deliberadamente más difícil de detectar, y encima se somete a una purificación que elimina el ARN de doble cadena generado como subproducto. No tiene sentido que la protagonista del efecto potenciador sea precisamente una molécula diseñada para no ser detectada.

El trabajo que traigo hoy es un artículo de npj Vaccines de 2025 que interroga al sospechoso que queda: la nanopartícula lipídica (lipid nanoparticle, LNP) en sí misma. Usando una línea celular de monocitos humanos, los autores comprobaron si una «LNP vacía», sin ARNm dentro, basta por sí sola para encender el interruptor de la inmunidad innata.

Adelanto la conclusión: se encendió. Y, además, añadir ARNm no aumentó la respuesta. Las claves estaban en uno de los cuatro componentes lipídicos, el lípido ionizable, y en un receptor que se supone vigilante de las toxinas bacterianas, TLR4.

Lo advierto con toda claridad desde el principio: este artículo no dice que las vacunas de ARNm sean peligrosas. Que la inmunidad innata se active es, precisamente, el mecanismo por el que la vacuna funciona. Lo que este trabajo persigue es identificar ese mecanismo para poder llegar a un diseño que reduzca la reactogenicidad manteniendo la eficacia. Más adelante le dedico un apartado entero.

Este artículo forma pareja con «Si contamos una por una las nanopartículas lipídicas que transportan ARNm», publicado el mismo día. Aquel trata de que «la mayoría de las LNP van sin carga»; este, de que «esas partículas sin carga desencadenan la respuesta inmunitaria». Leídos juntos, ganan bastante.

Datos de la publicación

• Título del artículo: Ionizable lipid nanoparticles of mRNA vaccines elicit NF-κB and IRF responses through toll-like receptor 4 (las nanopartículas lipídicas ionizables de las vacunas de ARNm inducen respuestas de NF-κB y de IRF a través del receptor de tipo Toll 4)
• Tipo de artículo: artículo original (vacunología e inmunidad innata)
• Revista: npj Vaccines 2025, volumen 10, artículo número 73 (recibido el 2 de mayo de 2024, aceptado el 24 de marzo de 2025). Es una revista de acceso abierto de la familia Nature, asociada al Sealy Institute for Vaccine Sciences de la Rama Médica de la Universidad de Texas en Galveston (UTMB)
• DOI / enlace: 10.1038/s41541-025-01124-x
• Licencia: acceso abierto (CC BY 4.0). Incluye además una nota relativa a las obras realizadas por empleados del Gobierno de los Estados Unidos en el ejercicio de sus funciones (título 17, sección 105, del Código de los Estados Unidos)
• Impact Factor: aproximadamente en torno a 7 (varía según el año; dentro de las revistas especializadas en vacunología está en la franja alta)
• Autores: ocho en total: Amanda E. Zelkoski (primera autora), Zhongyan Lu, Gauthaman Sukumar, Clifton Dalgard, Hooda Said, Mohamad-Gabriel Alameh, Edward Mitre y Allison M. W. Malloy (autora corresponsal)
• Filiación: los departamentos de Pediatría, de Anatomía, Fisiología y Genética y de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Servicios Uniformados de Ciencias de la Salud de los Estados Unidos (Uniformed Services University of the Health Sciences, USU, en Bethesda, Maryland), la Henry M. Jackson Foundation, el Departamento de Patología del Hospital Infantil de Filadelfia (CHOP), el Departamento de Patología de la Universidad de Pensilvania y el Penn Institute for RNA Innovation
• Financiación: una ayuda RAMP del Departamento de Pediatría y fondos del Departamento de Defensa y de la Agencia de Salud de la Defensa de los Estados Unidos (HU00012020067 y HU00012120094 del Defense Health Program, y HU00012120104 de la Immunization Healthcare Branch). El artículo deja constancia expresa de que «los financiadores no participaron en el diseño del estudio, ni en la recogida, el análisis o la interpretación de los datos, ni en la redacción del informe, ni en la decisión de enviarlo a publicar»
• Declaración de conflictos de interés: los autores declaran no tener ningún conflicto de interés comercial ni económico
• Disponibilidad de datos: los datos de secuenciación de ARN están depositados en el NCBI Sequence Read Archive con el código PRJNA1196969. El resto de los datos se facilitan a petición

¿Qué clase de investigadora es la autora corresponsal?

La autora corresponsal, Allison M. W. Malloy, es profesora asociada de Pediatría en la Facultad de Medicina F. Edward Hébert de la Universidad de Servicios Uniformados y dirige el Laboratory of Infectious Diseases and Host Defense. Al mismo tiempo ejerce como clínica en el servicio de enfermedades infecciosas pediátricas del Centro Médico Militar Nacional Walter Reed. Es docente de esa facultad desde 2013 y, antes de eso, fue becaria de investigación clínica en el Centro de Investigación de Vacunas del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de los Estados Unidos.

El eje de su investigación ha sido siempre el mismo: «en qué punto la respuesta inmunitaria frente a los virus respiratorios protege y en qué punto empeora la enfermedad». Trabaja desde hace mucho sobre el virus respiratorio sincitial (respiratory syncytial virus, RSV) y la inmunidad de los lactantes, y ha desarrollado modelos de ratón para estudiar el desarrollo de la inmunidad mucosa frente al RSV en la vía aérea. Según la información pública, participa en trabajos que muestran que, en ratones neonatos, aumentar la activación de la inmunidad innata junto con una mayor exposición al antígeno genera linfocitos T de memoria residentes en el pulmón y protege frente al RSV, y también en estudios de cohortes prospectivas de niños que siguen el desarrollo de la inmunidad mucosa y circulante frente a los virus respiratorios. Entre sus colaboradores figuran el NIAID (Centro de Investigación de Vacunas, Laboratorio de Enfermedades Infecciosas y Sección de Inmunobiología de Mucosas), el Hospital Infantil de Filadelfia y el Instituto de Investigación del Ejército Walter Reed.

🧬 Dr. Exotaro: Con esa trayectoria en la cabeza, el propósito del artículo se entiende mejor. Una clínica que lleva años pensando en «cómo conseguir en lactantes y en personas mayores una inmunidad fiable con el menor estímulo posible» se pregunta qué es en realidad el adyuvante de esta vacuna. Ese es el artículo. Más que curiosidad pura, lo que asoma en primer plano es el deseo de conocer el mecanismo para poder diseñar.

Hay otra persona, un coautor decisivo sin el cual este trabajo no existiría: Mohamad-Gabriel Alameh (Hospital Infantil de Filadelfia, Universidad de Pensilvania y Penn Institute for RNA Innovation). Según el apartado de contribuciones, aportó las LNP utilizadas en los experimentos y contribuyó también al diseño del estudio. Alameh publicó en Immunity 2021, volumen 54, página 2877, un artículo titulado «Las LNP aumentan la eficacia de las vacunas de ARNm y de las vacunas de subunidades proteicas al inducir potentes respuestas de linfocitos T colaboradores foliculares y de anticuerpos», y el trabajo de hoy es su continuación. La Universidad de Pensilvania es la casa matriz de la tecnología de las vacunas de ARNm, de modo que la figura es esta: esa misma casa matriz impulsa por su cuenta una investigación que apunta a que el potenciador es el envase. La primera autora, Zelkoski, concibió y diseñó el estudio junto con Malloy, realizó todos los experimentos y redactó el manuscrito.

Para empezar, ¿qué era lo que no sabíamos hasta ahora?

El enigma de que «funcione sin adyuvante»

La inmunogenicidad de las vacunas de ARNm está demostrada, pero el artículo plantea de entrada dos problemas pendientes: que la duración de la protección es limitada y que no se conoce la causa de la reactogenicidad (reactogenicity). Ninguno de los dos se puede mejorar mientras no se sepa por qué mecanismo se pone en marcha la inmunidad.

Las vías de detección candidatas son varias. El ARNm (ARN de cadena sencilla) puede ser reconocido por TLR7 y TLR8, y el ARN de doble cadena generado como subproducto, por TLR3, RIG-I y MDA5. Pero, como ya he dicho, el ARNm de las vacunas actuales está fabricado —con modificación y purificación— precisamente para esquivar todo eso.

👦 Estudiante: Si está fabricado para no ser detectado, ¿por qué se genera inmunidad?

🧬 Dr. Exotaro: Ahí está el enigma, y por eso la mirada se volvió hacia el envase. En realidad había pistas. Varios trabajos, tanto en cultivos celulares como en ratones, habían descrito que la inmunidad innata se pone en marcha con la LNP sola, sin ARNm dentro. Si se aplican LNP vacías a células dendríticas humanas derivadas de monocitos, salen citocinas como IL-1, IL-6, IL-12, interferón α e interferón γ. Este artículo cita una revisión y escribe que «el 61% desencadenó una respuesta inmunitaria» (pero lo que cuenta la fuente citada son los trabajos publicados sobre nanopartículas lipídicas, no el 61% de las formulaciones de LNP ni el 61% de las personas vacunadas; aquí también el significado cambia cuando uno se remonta a la fuente).

Una pista más concreta venía de los estudios en ratón del coautor Alameh y su grupo: la actividad adyuvante de las LNP ionizables vacías dependía en parte de MyD88. Como MyD88 es una molécula adaptadora que actúa por debajo de los TLR y del receptor de IL-1, eso sugiere que hay un TLR implicado. Y, en ese mismo trabajo, al retirar el lípido ionizable la producción de citocinas disminuyó.

¿Por qué no bastaba con saber que «la LNP vacía estimula»?

A estas alturas, que «la LNP vacía estimula el sistema inmunitario» estaba prácticamente establecido. Lo que faltaba era identificar la vía: por qué receptor pasa, qué factores de transcripción mueve y cuál de los componentes es el responsable.

Y además los trabajos previos se contradecían: hay informes que, en modelos de ratón, no encontraron pruebas de que los TLR estuvieran implicados. Para ordenar esa contradicción hacía falta destruir, de uno en uno, los receptores y los adaptadores en células humanas y comparar.

¿Qué hay que medir para tener una respuesta?

El centro del interruptor de la inmunidad innata son dos familias de factores de transcripción.

• NF-κB (nuclear factor-kappa B, factor nuclear kappa B): gobierna la producción de citocinas inflamatorias y de quimiocinas
• IRF (interferon regulatory factor, factor regulador del interferón): gobierna la producción de interferón de tipo I

Cuando un TLR recibe un estímulo, esas dos familias se activan a través de un adaptador: MyD88 o TRIF.

Los autores emplearon THP-1-Dual, una línea celular humana de tipo monocítico. Son células con dos indicadores incorporados: cuando se activa NF-κB aparece fosfatasa alcalina secretada (SEAP) en el medio de cultivo, y cuando se activa IRF aparece una luciferasa secretada. Basta tomar el medio y medir color y luz para convertir en números el grado de activación del interruptor.

👦 Estudiante: ¿Por qué monocitos?

🧬 Dr. Exotaro: El monocito es una célula de la inmunidad innata de primera línea que patrulla la sangre y reacciona con rapidez a las señales que emiten los patógenos o las células dañadas. También es la célula que acude al lugar de la inyección y que presenta el antígeno para pasar el relevo a los linfocitos T. Es una elección razonable como representante de la célula que se encuentra primero con lo ajeno. Eso sí: se trata de una línea celular inmortalizada procedente de un paciente con leucemia, no de células de una persona de carne y hueso. Volveré sobre esto para criticarlo a fondo.

¿Qué ha averiguado este artículo?

Los cuatro envases preparados

El diseño de la comparación es nítido: prepararon cuatro tipos de LNP.

Todas contienen colesterol, DSPC (lípido auxiliar) y un lípido PEG. El lípido PEG de LNP-ALC315 es ALC-0159, y el de LNP-SM102, PEG-DMG. Como controles se usaron R848 (agonista de TLR7/8) y MPLA (agonista de TLR4), además de TNFα (50 pg/mL) e interferón α (5 ng/mL). Todas las LNP se administraron a 1 µg/mL (cantidad expresada como equivalente de ARNm).

① Con la LNP vacía sola, el interruptor se encendió

NF-κB se detectó a las 24 horas, aumentó a las 48 y se mantuvo prácticamente en meseta hasta las 120 horas.

• LNP-ALC315: a las 24 horas, 2 veces el control sin estimular; a partir de las 48 horas, 4 veces
• LNP-1: a las 48 y 72 horas, 6-7 veces (la más intensa)
• LNP-SM102: del mismo orden que LNP-ALC315

IRF fue más discreto que NF-κB. LNP-ALC315 alcanzó 3 veces a las 48 horas y 1.7 veces a las 72 horas. LNP-1 se situó en el mismo orden que LNP-ALC315, y el resultado fue que LNP-SM102 era significativamente más intensa. R848 mostró la respuesta de IRF más potente de todas.

En todas las LNP la respuesta fue dependiente de la dosis y se saturó a dosis altas (en el caso de IRF, la saturación llegó a 2 µg/mL).

② La causa era el lípido ionizable

Este es el núcleo del artículo. Cuando se aplicó la LNP a la que solo se había retirado el lípido ionizable, desaparecieron tanto la respuesta de NF-κB como la de IRF.

👦 Estudiante: ¿Con retirar solo uno de los cuatro componentes lipídicos se queda en cero?

🧬 Dr. Exotaro: Así es. Siguen estando el colesterol, el DSPC y el lípido PEG, y aun así no hay respuesta. Es un resultado extraordinariamente fácil de leer: el lípido ionizable es la fuente del estímulo. Pero —y esto hay que decirlo con honestidad— el lípido ionizable retirado es el componente mayoritario entre los lípidos de la LNP (aunque este artículo no indica las proporciones molares de su propia formulación: solo los nombres de los componentes). Si se quita, lo que queda no es «la misma partícula a la que le falta un componente», sino una partícula distinta. De hecho, ese control tenía un diámetro de 80.26 nm, mayor que los 54.07 nm de LNP-ALC315. Volveré sobre ello en el apartado de lectura crítica.

③ La vía era TLR4 y MyD88

El siguiente paso es identificar el receptor. Los autores empezaron mirando la expresión génica de forma exhaustiva.

Secuenciaron el ARN de células THP-1 estimuladas 24 horas con LNP-1, con cuatro muestras por condición, y concluyeron que de los 57,773 genes detectados, 10,585 eran genes con expresión diferencial (tasa de falsos descubrimientos de 0.01 y log2 del cambio de expresión mayor que 1 o menor que −1).

Entre las subunidades de NF-κB subieron con fuerza NFKB2 (log2 del cambio de expresión 2.35) y RELB (2.74), y NFKB1 también aumentó de forma significativa, con 0.67 (se quedó justo por debajo del criterio). Entre los IRF subieron IRF7 (3.07), IRF4 (1.96), IRF9 (1.46) e IRF3 (0.19). Todo ello concuerda con los resultados de los experimentos con indicadores.

Después, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) detectó la elevación de la vía de señalización de los receptores de tipo Toll de la base de datos KEGG. Si se miran los genes de esa vía, aparecen en fila CD14 (4.07), CD86 (2.96), FOS (2.15), JUN (1.93), CD40 (1.26), STAT1 (1.18), MYD88 (0.97), TICAM1 (0.77, que codifica TRIF) y TLR4 (0.60). También se confirmó a nivel de proteína: por citometría de flujo, CD14 y CD86 habían aumentado unas 2 veces, y CD40, 1.3 veces.

Y aquí los autores entran en el asunto de fondo: emplean células THP-1 con una inactivación génica (knockout) de TLR4.

El resultado: en todas las LNP ionizables, tanto la respuesta de NF-κB como la de IRF cayeron de forma notable. Pero no llegan a cero del todo. Los autores lo formulan con prudencia: «TLR4 es el receptor principal, aunque otras vías pueden contribuir».

Un detalle cuidadoso: midieron si las LNP estaban contaminadas con endotoxina y confirmaron que estaba por debajo del límite de detección. Como la endotoxina (el LPS bacteriano) es el ligando natural de TLR4, cualquier contaminación echaría a perder el resultado.

También destruyeron los adaptadores. Con el knockout de MyD88, las respuestas de NF-κB y de IRF bajaron con las tres LNP. En cambio, con el knockout de TRIF la respuesta de NF-κB a LNP-1 subió ligeramente, y las de LNP-ALC315 y LNP-SM102 bajaron, aunque no tanto como con el knockout de MyD88.

🧬 Dr. Exotaro: Es decir, la vía principal es de TLR4 a MyD88, y la participación de TRIF varía según la formulación. Y hay algo más: en A549 (una línea celular de epitelio pulmonar humano), que no expresa TLR4, ninguna LNP provocó respuesta.

④ Ocurre en la superficie de la célula, pero hace falta suero

Había algo extraño en los tiempos de la respuesta. La señalización suele llegar a la fosforilación de los factores de transcripción en alrededor de 1 hora, pero el pico de la respuesta a las LNP está en las 48-72 horas. Los agonistas de TLR se disparan con fuerza en menos de 24 horas; las LNP son lentas.

Los autores pensaron que quizá hiciera falta que la partícula fuese internalizada. Al seguir LNP marcadas con el fluorocromo DiO, la internalización se aprecia en menos de 2 horas y alcanza su máximo a las 48 horas. Probaron entonces cuatro inhibidores de la endocitosis (dinasore, citocalasina D, cloroquina y metil-β-ciclodextrina).

El resultado fue inesperado. Solo la cloroquina redujo la respuesta de IRF, pero, como con dinasore, que inhibe esa misma vía dependiente de clatrina, no hubo cambio alguno, se concluyó que el efecto de la cloroquina es probablemente una acción fuera de diana.

⚠️ Aquí conviene añadir un comentario sobre cómo está escrito el artículo. El trabajo presenta la cloroquina como «inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina, CME», pero la cloroquina es en realidad un fármaco lisosomotrópico y su acción principal es detener la acidificación del endosoma. No es un fármaco que bloquee la CME en sí. El razonamiento de los autores —«como discrepa con dinasore, será una acción fuera de diana»— se sostiene como tal, pero la clasificación del fármaco está descrita de forma inexacta. En conjunto, los inhibidores no influyeron de forma significativa en la respuesta a las LNP.

La prueba decisiva es la localización: las LNP marcadas con DiO y TLR4 no colocalizaron en el marcador de endosoma temprano Rab5a. Es decir, cabe pensar que el encuentro con TLR4 ocurre en la superficie de la célula. Y, como se sabe que TLR4 usa MyD88 en la superficie y TRIF después de la endocitosis, eso encaja con el resultado de que MyD88 predomina.

Eso sí, los autores escriben expresamente que «no se puede descartar por completo la señalización desde el endosoma», porque la inhibición no fue suficiente.

Otro hallazgo fue la necesidad de suero: al pasar a un medio sin suero, tanto la respuesta de NF-κB como la de IRF cayeron de forma significativa.

👦 Estudiante: ¿Por qué hace falta el suero?

🧬 Dr. Exotaro: El artículo señala dos posibilidades. Una es la corona de proteínas: las proteínas del suero forman una capa sobre la superficie de la LNP y esa capa ayuda a engancharse al receptor. La otra es la proteína de unión a LPS (LBP), cuyo papel natural es entregar el LPS a TLR4. El artículo no decide entre las dos. Pero la sugerencia es importante: como la composición de la corona de proteínas cambia con el entorno, la corona que se forma en el cuerpo tras una inyección intramuscular debe de ser distinta de la que se forma tras una intravenosa. Y el suero dentro de un tubo de ensayo tampoco es el mismo ambiente que el interior de un músculo humano. Esto queda explícitamente señalado como tarea pendiente.

⑤ Y, al añadir ARNm, la respuesta no aumentó

El último punto es el resultado más inesperado del artículo.

Los autores esperaban que «la LNP cargada con ARNm diera una respuesta más intensa». Pero, al medirlo, la respuesta de la LNP con ARNm era del mismo orden que la de la LNP vacía correspondiente, o incluso menor. La expresión de CD86 en la superficie también fue del mismo orden. Como R848 sí daba una respuesta potente, la vía de TLR7/8 está intacta. Y, aun así, el ARNm no sumó nada.

La conclusión de los autores es esta: «las LNP ionizables son capaces de activar por completo la inmunidad innata en el modelo de monocitos sin necesidad de ARNm, y añadir ARNm no aumentó la respuesta». Dicho de otro modo: el principal adyuvante de la vacuna BNT162b2 es la LNP.

⚠️ Leer este resultado como «la vacuna es peligrosa» es un error

Le dedico un apartado propio. Este tipo de resultados se cita mal con facilidad, así que conviene ordenar qué dice y qué no dice el artículo.

Primero: la activación de la inmunidad innata es una condición necesaria para que la vacuna funcione. Un adyuvante es, exactamente, el componente que se añade buscando eso. Los agonistas de TLR se usan de hecho como adyuvantes en ensayos clínicos y en vacunas aprobadas. Decir que «la LNP desencadena la inmunidad innata» no es señalar un defecto, sino explicar por qué las vacunas de ARNm funcionan sin adyuvante. En palabras de los propios autores, el objetivo es «obtener información que permita mejorar la inmunogenicidad y/o la reactogenicidad de las vacunas futuras».

Segundo: esto es un experimento en una línea celular en cultivo. No hay experimentos en animales ni datos en humanos. Tampoco es un estudio que haya medido la intensidad de la reactogenicidad. No es un artículo que establezca «esta es la causa de los efectos secundarios», sino uno que dice: «el mecanismo de la activación de la inmunidad innata es este, y por eso hay margen para ajustarlo».

Tercero: las LNP que se midieron no son las vacunas comerciales. Tal como consta en el apartado de métodos, se fabricaron «siguiendo» la formulación: son reconstrucciones hechas en el laboratorio. (No tome las cifras del diámetro como fundamento. Como explicaré más adelante, los 90.2 nm y los 75.5 nm que el artículo cita como «valores del producto comercial» eran en realidad los valores de unas LNP que otro estudio fabricó por su cuenta. El fundamento está en la descripción de los métodos.)

Cuarto: el artículo expone con honestidad los trabajos previos que lo contradicen. Deja constancia de que hay informes según los cuales, en ratones, suprimir TLR4 no hizo desaparecer la respuesta a la vacuna, y de que hay informes que señalan a MDA5 como la pieza clave; también escribe que la señalización de los TLR no coincide por completo entre humanos y ratones.

🧬 Dr. Exotaro: Como médico, trato este tipo de asuntos con cuidado. Lo que este artículo ha mostrado es que se ha averiguado una parte del mecanismo por el que la vacuna funciona. Y, una vez que se sabe, se puede aspirar a un diseño que consiga el mismo efecto con menos estímulo. Esa es la dirección en la que van los autores.

¿Cómo cambiará el futuro? (el camino hacia la clínica)

La vía de «diseñar el lípido para ajustar la respuesta inmunitaria»

La aplicación que el artículo muestra con más claridad es esta: si se cambia la estructura del lípido ionizable, se puede cambiar la intensidad del estímulo de la inmunidad innata.

Hay tres fundamentos. Uno: al retirar el lípido ionizable, la respuesta desapareció. Dos: la magnitud y el patrón de la respuesta fueron distintos en las tres LNP: en LNP-SM102 el IRF fue el más intenso, en LNP-1 el NF-κB fue el más intenso y en LNP-ALC315 el NF-κB fue del mismo orden que en LNP-SM102 y el IRF, del mismo orden que en LNP-1 (así lo describe el artículo). Si la estructura cambia, la respuesta cambia. Tres: los trabajos previos están identificando los elementos estructurales responsables. Entre lo que cita el artículo hay un informe según el cual la estructura de la cabeza amínica del lípido ionizable determina la respuesta inmunitaria a través de su unión a TLR4 y a CD1d (Nature Biomedical Engineering 2024, volumen 8, página 1483) y otro según el cual las diferencias en el grupo de cabeza de los lípidos catiónicos modulan la señalización de TLR4.

🧬 Dr. Exotaro: Los autores lo comparan con el hecho de que la estructura del LPS varía según la especie bacteriana y, con ella, la intensidad de la señal de TLR4. En la naturaleza existe un rango continuo entre los ligandos fuertes y los ligandos débiles de TLR4. Si es así, con los lípidos también debería poderse elegir en qué punto de ese rango situarse. Esa es la idea.

De aquí salen dos direcciones para la formulación. Si lo que se quiere es aumentar la actividad adyuvante —por ejemplo en personas mayores o lactantes, en quienes la respuesta inmunitaria cuesta más, o en las vacunas contra el cáncer—, se elige un lípido ionizable potente. Si lo que se quiere es contener la reactogenicidad, se elige uno débil. Es decir: un lípido que hoy se selecciona casi exclusivamente por su «eficiencia de administración» podrá seleccionarse también por un criterio inmunológico.

«Más que retocar el ARNm, lo que funciona es retocar el lípido»

El giro que apunta la última frase del artículo también es importante. Los autores escriben: dado que el principal motor de la activación de la inmunidad innata es la LNP y no el ARN, en lugar de seguir modificando el ARNm conviene dedicar el esfuerzo a entender cómo fabricar LNP capaces de dirigirse a vías de señalización concretas.

La optimización del lado del ARNm (nucleósidos modificados, purificación, UTR, codones) ya está bastante avanzada. Lo que este artículo viene a decir es que el margen de mejora que queda está en el lado del envase.

Lo que se ve al superponer los dos artículos

Superpongamos ahora el otro artículo publicado el mismo día: el trabajo de Nature Communications de 2022 según el cual el 77% de las LNP iban sin carga.

Aquel midió que «las partículas que llevan ARNm son solo el 23% del total». Este ha medido que «con las partículas vacías solas la inmunidad innata se activa por completo, y añadir ARNm no la aumenta». Si se superponen sin más, el cuadro que sale es que la mayor parte de la actividad adyuvante de una dosis de vacuna administrada corre a cargo de partículas que no llevan ni una sola molécula de ARNm.

👦 Estudiante: ¿Es esa una conclusión que se pueda sacar de estos dos artículos?

🧬 Dr. Exotaro: A medias. Como razonamiento parece natural, pero hay dos advertencias. Una: el lípido ionizable del artículo que midió la proporción de partículas vacías es DLin-MC3-DMA, no los ALC-0315 y SM-102 de este. Nadie ha medido cómo varía esa proporción de una formulación a otra. Dos: con la forma de igualar la dosis que usa el artículo de hoy —«1 µg/mL de equivalente de ARNm»—, el texto no permite seguir del todo cómo se hizo coincidir la cantidad total de lípido entre la LNP vacía y la LNP con ARNm. Por eso lo correcto es decir «se sugiere», y nada más.

Aun así, me parece una pregunta aguda. Una mejora de la formulación que reduzca las partículas vacías podría elevar la eficiencia de administración, pero al mismo tiempo podría rebajar la actividad adyuvante. Los dos indicadores pueden estar en compromiso uno con otro. Darse cuenta de esa posibilidad solo es posible leyendo los dos artículos en paralelo.

La distancia hasta la clínica

Lo escribo sin rodeos: este artículo no tiende ningún puente directo a la clínica. Es un experimento con líneas celulares. La reactogenicidad en animales, la tolerabilidad en humanos y la relación con la duración de la inmunidad están todas sin comprobar. Aun así, tiene valor haber identificado «el mando que hay que ajustar»: si no se sabe dónde está el mando, tampoco se puede girar.

Cómo leer este trabajo con ojo crítico (límites y vías para mejorar su calidad)

Lo que merece reconocimiento

Lo digo con equidad. El diseño de la comparación es correcto: en las mismas células, a la misma dosis y en los mismos momentos, pone en fila tres formulaciones de LNP reales y una «a la que se le ha retirado el lípido ionizable». Lo comprueban destruyendo genes: usar líneas celulares con knockout individual de TLR4, de MyD88 y de TRIF es una prueba muchísimo más sólida que fiarse de los inhibidores. Miden y excluyen la contaminación por endotoxina, un trabajo imprescindible cuando se discute sobre TLR4 y que no son pocos los artículos que se saltan. El orden de los pasos también es limpio: formular la hipótesis a partir del análisis exhaustivo, verificarla destruyendo genes concretos y respaldarla a nivel de proteína. No esconden los resultados negativos: escriben todo —que con el knockout de TRIF el NF-κB de LNP-1 subió en lugar de bajar, que al destruir TLR4 la respuesta no desaparece del todo, que la inhibición de la endocitosis no es concluyente y que hay trabajos previos que lo contradicen—. Y, además, publican los datos de secuencia.

Lo que conviene leer con cautela

① Se carga demasiado peso sobre una sola línea celular. Todas las conclusiones principales salen de THP-1, es decir, de una línea inmortalizada procedente de un paciente con leucemia monocítica aguda. A549, que se usó de forma auxiliar, es también una línea derivada de un cáncer de pulmón. No hay datos de monocitos primarios humanos ni de células dendríticas derivadas de monocitos, ni hay experimentos en animales. En una línea celular, tanto el nivel de expresión de los receptores como el umbral de señalización se desvían de los de una célula real. Es el precio de la gran ventaja de poder usar knockouts, pero para generalizar diciendo «en las células de la inmunidad innata humana» falta todavía un paso.

② El control sin lípido ionizable es «otra partícula». Lo repito: este es el factor de confusión más grande. El lípido ionizable es el componente mayoritario entre los lípidos de la LNP (como este artículo no indica las proporciones molares, por el artículo no se puede saber cuánto se retiró). La partícula resultante tenía un diámetro de 80.26 nm (frente a 54.07 nm del control LNP-ALC315) y un potencial zeta de −8.548 (frente a −4.447 del control; el artículo lo indica sin unidades, que por convención serían mV), de modo que cambian tanto el tamaño como la carga superficial. Con ello deberían cambiar también la forma de internalizarse, la estabilidad y la corona de proteínas. Por tanto, que «la respuesta desapareciera» no demuestra que «el lípido ionizable sea el ligando», sino solo que «no hay respuesta si la partícula no contiene lípido ionizable». Hay pruebas independientes que apoyan a los autores (los trabajos previos según los cuales la estructura de la cabeza amínica determina la unión a TLR4), pero este artículo, por sí solo, no demuestra que la molécula lipídica se haya unido a TLR4. Con experimentos que redujeran la cantidad de forma gradual, o que la sustituyeran por un lípido no ionizable de forma parecida, la afirmación habría quedado mucho más sólida.

③ La caracterización de las partículas es débil. El diámetro, el PDI y el potencial zeta son todos un único valor por condición y, además, están escritos con cifras que no significan nada, como los 51.590 nm de LNP-SM102 o el −4.447 del potencial zeta de LNP-ALC315 (el potencial zeta aparece sin unidades). Las mediciones repetidas y la desviación estándar no se informan (por el artículo no se puede distinguir si no se hicieron o si simplemente no se informaron). Y, además, no se informa el diámetro de LNP-1 ni de mRNA-LNP-1. Hay también aquí una comparación que se derrumba cuando uno se remonta a la fuente citada. La introducción del artículo cita como diámetros de «las LNP de la vacuna» de BNT162b2 y de mRNA-1273 los valores de 90.2 ± 7.8 nm y 75.5 ± 0.4 nm (la fuente es Zhang L y cols., npj Vaccines 2023;8:156). Pero al leer esa fuente se ve que lo que se midió no son las vacunas comerciales. Son los valores de unas LNP cargadas con ARNm de luciferasa de luciérnaga que ese mismo estudio fabricó, con una proporción molar de lípidos de 50:10:38.5:1.5. La propia fuente citada escribe expresamente que «la composición de estas LNP no es la misma que la de las vacunas de Pfizer/BioNTech o de Moderna».

Es decir: poner en fila los 54.07 nm de este trabajo y los 90.2 nm citados es comparar dos reconstrucciones, no demostrar que «sean distintas del producto comercial». Esa atribución errónea está del lado de este artículo, y yo mismo la di por buena al principio. Dicho eso, el hecho de que «lo que se midió son reconstrucciones basadas en la formulación y no las vacunas comerciales» sigue siendo válido sin cambios a partir de la descripción de los métodos (fabricadas «siguiendo» la formulación); lo único es que su fundamento no son las cifras del diámetro.

④ El estado de modificación del ARNm utilizado no figura en los métodos. Como esto afecta al centro de la afirmación, lo señalo de forma concreta. El apartado de métodos indica que el ARNm codifica la espícula de la variante ómicron del SARS-CoV-2 (S2P), que se le puso la caperuza de forma cotranscripcional con CleanCap, que se purificó por cromatografía de celulosa, que la eliminación del ARN de doble cadena se verificó por dot blot y que se midió la endotoxina (por debajo de 0.05 EU/mL). Pero no dice si se hizo la modificación con N1-metilpseudouridina. Como la introducción del artículo parte precisamente de que «el ARNm de las vacunas actuales está modificado», saber si su propio ARNm estaba modificado o no es una información esencial. Si no estuviera modificado, resultaría que ni siquiera un ARNm que debería estimular más añadió nada, lo cual favorece a los autores; pero si estaba modificado, también se puede leer como «estuvo callado gracias a la modificación». El lector se queda sin poder elegir entre las dos interpretaciones.

⑤ La comparación con las versiones cargadas de ARNm es limitada. Solo se fabricaron LNP con ARNm en dos casos, LNP-1 y LNP-ALC315, y no existe mRNA-LNP-SM102. La comparación se hizo en un solo punto temporal, a las 72 horas. El alcance de la conclusión de que «el ARNm no suma nada» se queda dentro de ese margen. Además, los propios autores, al explicar la discrepancia con un trabajo previo que usó BNT162b2 de producción GMP (el informe que señala a MDA5 como pieza clave), alegan que su ARNm estaba purificado con celulosa. Es decir, los autores también admiten que el resultado puede cambiar según cómo se fabrique el ARNm.

⑥ Hay un punto en el que el texto se contradice con su propia tabla. Sobre los IRF, los autores escriben que «de los IRF que subieron, los únicos que cumplieron el criterio de gen con expresión diferencial fueron IRF4 e IRF7». Pero en la tabla de esa misma figura aparece IRF9 con un log2 del cambio de expresión de 1.46 y un valor p ajustado de 3.3 × 10⁻⁵⁸. Eso cumple con claridad el propio criterio de los autores (log2 del cambio mayor que 1 y tasa de falsos descubrimientos de 0.01). No es un error que cambie la conclusión, pero quien vaya a citar las cifras necesita mirar la tabla.

⑦ La descripción de la estadística no es coherente. El apartado de análisis estadístico solo menciona el análisis de la varianza de una vía (con Dunnett o con Tukey), pero en los pies de figura se usa además la prueba t. El pie de la figura 4 dice que «la significación se evaluó mediante la prueba t (A), o mediante análisis de la varianza de una vía con comparaciones múltiples de Dunnett (A, B), o mediante la prueba t de Student (C)», es decir, asigna al panel A dos pruebas distintas. El lector no sabe con cuál se obtuvo cada valor. Además, en los pies de las figuras 2 y 4 el cuarto nivel de significación aparece impreso con tres asteriscos (***P ≤ 0.001, ***P ≤ 0.0001). Es un defecto de corrección de pruebas.

⑧ No se define qué contiene la n = 3. Los métodos dicen que «para cada condición se realizaron réplicas biológicas y réplicas técnicas», y los pies de figura indican n = 3. No se puede saber si esos 3 son réplicas biológicas independientes o réplicas técnicas del mismo cultivo. Y los datos se presentan con el error estándar de la media (SEM) y no con la desviación estándar, lo que hace que la dispersión parezca menor.

⑨ Queda el factor de confusión de la muerte celular. Los autores lo escriben con honestidad: la viabilidad bajó en todas las condiciones y a las 48 horas LNP-1 fue la que provocó la muerte celular más intensa, lo que se correspondía con la activación más intensa de NF-κB. Como las sustancias que salen de las células moribundas (DAMPs) pueden golpear TLR4, es imposible separar en principio si lo que se observa es «el estímulo producido por la LNP» o «el estímulo secundario producido por la muerte celular que la LNP provocó». Los autores sostienen que se trata de una vía distinta de la muerte celular, apoyándose en que LNP-SM102 provocó una muerte celular del mismo orden y, sin embargo, en ese momento apenas movió NF-κB, y en los trabajos previos según los cuales la estructura lipídica se une a TLR4. El argumento es convincente, pero el asunto no está cerrado.

⑩ El indicador mide un «valor acumulado». Tanto la SEAP como la luciferasa son enzimas secretadas que se van acumulando en el medio de cultivo. Lo que se mide no es la intensidad instantánea de la señal, sino algo más parecido a la suma de todo lo producido hasta ese momento. La observación de que «la respuesta a las LNP tiene su pico a las 48-72 horas y es más lenta que la de los agonistas de TLR» es interesante, pero también es el resultado combinado de que la internalización avanza poco a poco, de que las células se multiplican y de que la enzima se acumula. Con experimentos que hubieran seguido el curso temporal mediante indicadores directos, como la fosforilación, la discusión sobre la dinámica habría quedado mucho más firme.

⑪ No se midieron las citocinas como proteína. Las salidas de este trabajo son enzimas indicadoras, marcadores de superficie y transcritos. No se ha medido cuánta IL-6, cuánta IL-1β ni cuánto interferón salieron en realidad. Como base para discutir la reactogenicidad o la tolerabilidad, aquí hay un hueco.

⑫ LNP-1 es una formulación propietaria. LNP-1, que dio la respuesta de NF-κB más potente y que además fue la elegida como modelo para el análisis del transcriptoma, tiene una composición que no está publicada más allá de lo que figura en la patente. A un tercero le resulta difícil reproducirla solo con lo que dice el artículo y, además, no es la formulación de una vacuna aprobada. Apoyar en una formulación propietaria el pilar con el que se discute la generalidad del mecanismo es una debilidad, aunque hubiera motivos inevitables para hacerlo.

⑬ Un detalle menor: hay un error en la indicación de una filiación. La séptima filiación aparece como «Uniformed Services University of Health Sciences, Bethesda, PA», pero Bethesda está en Maryland (MD). El resto de las filiaciones figuran con MD.

¿Cómo habría sido un trabajo de mayor calidad?

• Reproducirlo en células primarias humanas. Confirmar al menos las conclusiones principales (la dependencia del lípido ionizable, la dependencia de TLR4 y la ausencia de aporte adicional del ARNm) en monocitos de sangre periférica y en células dendríticas derivadas de monocitos, compensando con anticuerpos neutralizantes e inhibidores el hecho de no poder usar knockouts
• En lugar de «retirar» el lípido ionizable, reducirlo o sustituirlo. Comparar tras igualar las propiedades de la partícula, con una respuesta a dosis escalonada o sustituyéndolo por un lípido no ionizable de forma parecida. Con el control actual no se puede separar la contribución de la molécula de la contribución de la partícula
• Informar la caracterización de las partículas con mediciones repetidas y para todas las formulaciones. Ajustar también las cifras significativas a lo que de verdad se ha medido. Y discutir de forma explícita las diferencias con los productos comerciales
• Indicar expresamente el estado de modificación del ARNm. Si es posible, poner en fila ARNm modificado y ARNm sin modificar, y compararlos también con material de producción GMP. Así se podría identificar la causa de la discrepancia con los trabajos previos
• Medir las citocinas como proteína. Con indicadores y transcritos solos no se puede llegar a una discusión sobre la reactogenicidad ni sobre la tolerabilidad
• Seguir en animales hasta los indicadores de reactogenicidad. La afirmación más importante, que «cambiando la estructura lipídica se puede ajustar el estímulo», hay que demostrarla al final tanto en tolerabilidad como en inmunogenicidad en el organismo vivo
• Revisar de forma mecánica las cifras, la estadística y los pies de tablas y figuras. La contradicción de IRF9, la duplicidad en la indicación de las pruebas, la errata de los asteriscos y el error del nombre del estado se eliminan con una lista de comprobación previa al envío

La perspectiva del Dr. Exotaro

El envase no es solo una caja que transporta el contenido

Lo digo con honestidad: la vacunología no es mi especialidad. A lo que yo me dedico es al tratamiento de enfermedades neurológicas, empezando por la lesión de la médula espinal, con células madre mesenquimales (mesenchymal stem cell, MSC) y las vesículas extracelulares (extracellular vesicle, EV) que estas liberan. Tampoco tengo experiencia trabajando con líneas celulares knockout de TLR4.

Y aun así he elegido este artículo porque lo que está escrito aquí da justo en el centro de nuestro campo.

Si resumo en una línea la lección de este artículo, sería esta: «el envase no es solo una caja que transporta el contenido; el envase mismo tiene actividad biológica». Y nuestro campo trabaja precisamente sobre esa línea.

Cuando explicamos el efecto terapéutico de las MSC-EV, lo que contamos casi siempre es el contenido: que este miARN frena la inflamación, que esta proteína ayuda a que el axón se extienda. Pero la EV es una partícula de bicapa lipídica, con tetraspaninas e integrinas incrustadas en la membrana y la superficie cubierta por una capa de proteínas. No es posible que esa membrana y esa superficie no estén haciendo nada a la célula que las recibe.

En particular, los efectos principales que se esperan de las MSC-EV —la inmunomodulación y la acción antiinflamatoria— no son, por su propia naturaleza, algo que tenga que ocurrir necesariamente después de entregar el contenido en el citoplasma. Podrían empezar en el instante mismo en que la partícula toca un receptor de la superficie celular. Es decir, en nuestro campo «la actividad biológica del envase» puede no ser un efecto secundario, sino el efecto principal que estamos buscando.

Este artículo lo ha mostrado con limpieza en un sistema sencillo de partículas sintéticas, usando células knockout. Se retiró un componente y la respuesta desapareció; se destruyó el receptor y la respuesta cayó. Cuando nosotros planteemos la misma pregunta con las EV, ¿podremos responder con esta limpieza? Retirar «solo ese componente» de una EV no es nada fácil.

TLR4 es uno de los protagonistas en el escenario de la lesión medular

Este es, para mí, el punto más concreto y el que más me ha hecho enderezarme en la silla.

TLR4 es un receptor que está en el centro de la fisiopatología posterior a la lesión medular. El tejido lesionado libera moléculas endógenas procedentes de las células destruidas (DAMPs), que impulsan la respuesta inflamatoria a través del TLR4 de la microglía y de los macrófagos. Esa respuesta actúa también en la dirección de extender el daño secundario y, al mismo tiempo, en la dirección necesaria para retirar los escombros y reparar: es una vía difícil de manejar, que no es simplemente «la mala» y cuyo significado cambia según la intensidad y el momento.

Y sobre eso superpongo el resultado de este artículo: las LNP de lípido ionizable activan la inmunidad innata a través de TLR4.

🧬 Dr. Exotaro: Si yo quisiera llevar ARNm o siRNA a una médula espinal lesionada mediante LNP, ¿qué estaría haciendo exactamente? Estaría vertiendo partículas que golpean TLR4 en un tejido en el que la inflamación ya corre por la señal de TLR4.

Esto es una inferencia mía a partir del artículo, no algo que el artículo haya demostrado. El trabajo no toca en absoluto el sistema nervioso central y habla de líneas celulares en cultivo. Entre la administración local y la sistémica, tanto la corona de proteínas como los tipos celulares a los que llega son completamente distintos. Por eso no se puede decir en absoluto que las LNP no sirvan para la lesión medular. Habrá situaciones en las que un estímulo moderado de la inmunidad innata en la zona lesionada resulte más bien beneficioso.

Aun así, no se debe elegir un transportador solo por su buena eficiencia de administración: ese punto concreto me parece algo que hay que llevarse a casa sin falta. Las propiedades inmunológicas del transportador se multiplican por el estado del tejido de destino. Según si se entrega en un tejido donde la inflamación corre o en un tejido tranquilo, la valoración del mismo transportador cambia.

¿Se refuerza entonces el motivo para usar EV como transportadoras?

Aquí voy a escribir con cuidado de no caer en la tentación.

«Como las EV son de origen biológico, son inmunológicamente silenciosas y más seguras que las LNP»: da ganas de decirlo. De hecho, las EV no contienen lípidos ionizables sintéticos. Pero ese razonamiento es peligroso. No hay ninguna prueba de que las EV sean inmunológicamente inertes. En la superficie de una EV hay moléculas muy diversas, y tanto el contenido como la superficie cambian con el estado de la célula donante. Si la EV es alogénica, las moléculas que presenta también pueden ser un problema. Que no contenga lípidos sintéticos no equivale a que no estimule el sistema inmunitario.

Lo que este artículo me ha impulsado a hacer es, más bien, lo contrario: cuando evaluemos una EV como transportadora, hay que medir sus propiedades inmunológicas desde el principio. No solo la eficiencia de administración y el análisis del contenido, sino también qué receptores toca y qué factores de transcripción mueve, al mismo nivel al que lo ha hecho este artículo.

Sobre la forma de escribir

Una última cosa. Lo que más confianza me ha dado de este artículo es que escriben en el cuerpo del texto lo que no le conviene a sus propias conclusiones.

Escriben que al destruir TLR4 la respuesta no desapareció del todo. Escriben que la inhibición de la endocitosis no resolvió la cuestión y que no se puede descartar la señalización desde el endosoma. Escriben que hubo una formulación en la que, al destruir TRIF, la respuesta subió en lugar de bajar. Plantean por su cuenta la posibilidad de que la muerte celular esté mezclada en lo observado. Escriben que hay informes según los cuales suprimir TLR4 en el ratón no hizo desaparecer la respuesta, que hay informes que señalan a MDA5 como la pieza clave y que los TLR de humanos y ratones no coinciden por completo. Y se ponen ellos mismos la reserva de que «hace falta seguir investigando para demostrar de forma definitiva la activación de IRF».

No mezclar lo medido con lo supuesto. Y presentar en el cuerpo del texto, no en una nota al pie, los trabajos previos que van en contra de la propia hipótesis. Me parece una actitud a la altura de un artículo que defiende un mecanismo.

Nota: este artículo se ha redactado con la ayuda de IA.