mRNA疫苗的“增强剂”不是内容物，而是容器——可电离脂质敲打TLR4，唤起先天免疫

疫苗里通常都加有佐剂（adjuvant，免疫增强剂）。光靠抗原，免疫系统不会真的当回事，所以要加进一种物质，去告诉先天免疫“这里有异物来了”。常用的有铝盐，以及模仿细菌成分的分子。

可是，mRNA疫苗里并没有加佐剂。成分表上只有mRNA和脂质。然而它却能带来很强的抗体和细胞免疫。也就是说，这种疫苗在自己身上的某个地方藏着佐剂的作用。

藏在哪里呢？

直觉上会想到mRNA。因为RNA本来就是会被当作异物感知的分子。可情况恰恰相反：现行疫苗的mRNA加入了N1-甲基假尿苷这种修饰，被刻意做成不容易被感知的样子，而且还做了纯化，把副产物双链RNA去掉。把一个被做成感知不到的分子当成增强剂的主角，这说不通。

这次要介绍的，是审问了剩下那个嫌疑人——脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle, LNP）本身——的2025年 npj Vaccines 论文。作者用人类单核细胞系，考察了单凭“没有装载mRNA的空LNP”能不能打开先天免疫的开关。

先把结论写在前面。开关打开了。而且加上mRNA之后，反应并没有增加。握着钥匙的，是四种脂质成分中的可电离脂质这一个，以及本应是在盯着细菌毒素的受体TLR4。

这里要先强调一句：这篇论文并不是“mRNA疫苗很危险”这种论调。先天免疫被激活这件事本身，就是疫苗之所以有效的机制。这篇论文想做的，是把这套机制定位出来，进而在保住效力的同时减少不良反应的设计。详细内容会在正文中单设一节来说明。

另外，本文与同日发布的《把运送mRNA的脂质纳米颗粒一颗一颗数下来》是成对的内容。那一篇讲的是“LNP的大多数都是空载的”，这一篇讲的是“那些空载的颗粒会引起免疫”。两篇对着读，会更有意思一层。

期刊信息

• 论文标题：Ionizable lipid nanoparticles of mRNA vaccines elicit NF-κB and IRF responses through toll-like receptor 4（mRNA疫苗的可电离脂质纳米颗粒通过Toll样受体4诱导NF-κB和IRF应答）
• 论文类型：原创研究论文（疫苗学·先天免疫）
• 发表期刊：npj Vaccines 2025年第10卷 论文编号73（2024年5月2日收稿，2025年3月24日接受）。它是 Nature 旗下的开放获取期刊，也是与得克萨斯大学医学部加尔维斯顿分校（UTMB）的 Sealy Institute for Vaccine Sciences 合作的期刊
• DOI / 链接：10.1038/s41541-025-01124-x
• 许可：开放获取（CC BY 4.0）。此外还附有关于美国政府雇员职务作品的规定（《美国法典》第17编第105条）的注记
• 影响因子：大致在7左右（逐年有波动。作为疫苗学的专业期刊属于上游）
• 作者：Amanda E. Zelkoski（第一作者）、Zhongyan Lu、Gauthaman Sukumar、Clifton Dalgard、Hooda Said、Mohamad-Gabriel Alameh、Edward Mitre、Allison M. W. Malloy（通讯作者）共8人
• 单位：美国军医大学（Uniformed Services University of the Health Sciences, USU，马里兰州贝塞斯达）的儿科学系、解剖生理与遗传学系、微生物学与免疫学系，Henry M. Jackson Foundation，费城儿童医院（CHOP）病理学系，宾夕法尼亚大学病理学系以及 Penn Institute for RNA Innovation
• 资助：儿科学系的 RAMP 基金，以及美国国防部国防卫生局的资助（Defense Health Program 的 HU00012020067、HU00012120094，Immunization Healthcare Branch 的 HU00012120104）。论文明确写道：“资助方没有参与研究设计、数据收集与分析与解释、报告的撰写、投稿的决定中的任何一项”
• 利益冲突披露：作者们申报没有商业性或金钱上的利益冲突
• 数据公开：RNA测序数据以 PRJNA1196969 的编号公开在 NCBI Sequence Read Archive。其他数据应要求提供

通讯作者是怎样的研究者

通讯作者 Allison M. W. Malloy 是美国军医大学 F. Edward Hébert 医学院儿科学的副教授，主持着 Laboratory of Infectious Diseases and Host Defense。同时，她也是沃尔特·里德国家军事医疗中心小儿感染科的临床医生。她从2013年起任该医学院的教员，在此之前曾在美国国立卫生研究院（NIH）下属国立过敏与感染病研究所（NIAID）的疫苗研究中心担任临床研究员。

她的研究主轴一贯是“针对呼吸道病毒的免疫应答，在哪里起到保护的作用，又在哪里起到让疾病加重的作用”。她特别长期致力于呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）与婴幼儿免疫，并建立了用于考察气道中RSV黏膜免疫发育的小鼠模型。据公开信息，她参与过这样的研究：在新生小鼠中提高先天免疫的活化程度，同时也增加抗原暴露，就会形成驻留在肺部的记忆T细胞并获得对RSV的保护；她也参与在儿童前瞻性队列中追踪针对呼吸道病毒的黏膜免疫与循环免疫发育的研究。合作研究方包括NIAID（疫苗研究中心、感染病研究室、黏膜免疫生物学组）、费城儿童医院、沃尔特·里德陆军研究所。

🧬 艾克索太郎：把这份经历摆在眼前，论文的用意就读得出来了。一位一直在思考“在婴幼儿和老年人身上，怎样才能用更少的刺激确实地建立起免疫”的临床医生，问出了“这支疫苗的佐剂到底是什么”——这就是这样一篇论文。与其说是纯粹的好奇心，更是为了设计而想知道机制这一动机摆在了前面。

还有另一位，是让这项研究得以成立的重要共同作者。那就是 Mohamad-Gabriel Alameh（费城儿童医院、宾夕法尼亚大学、Penn Institute for RNA Innovation）。按作者贡献一栏的记载，他提供了实验所用的LNP，也对研究设计有所贡献。他曾在 Immunity 2021年第54卷第2877页发表论文“LNP提高mRNA疫苗以及蛋白亚单位疫苗的效果——通过诱导强力的滤泡辅助性T细胞应答与抗体应答”，而本论文正是其续篇。宾夕法尼亚大学是mRNA疫苗技术的大本营，于是就形成了这个大本营自己在推进“增强剂的真身就是容器”这一方向的研究的格局。第一作者 Zelkoski 与 Malloy 一起构想并设计了研究，实施了全部实验，并撰写了稿件。

那么，在此之前究竟有什么还不清楚？

“没有佐剂却有效”这个谜

mRNA疫苗的免疫原性已经得到实证，但论文在开头举出了两个课题：持续时间有限，以及不良反应（reactogenicity）的原因还不清楚。这两者只要“免疫是通过什么机制立起来的”仍然不明，就都无法改善。

候选的感知通路有好几条。mRNA（单链RNA）可能被 TLR7、TLR8 感知，副产物双链RNA可能被 TLR3、RIG-I、MDA5 感知。可是如前所述，现行疫苗的mRNA经过修饰和纯化，就是为了避开这些而做成的。

👦 学生：明明是做成了不被感知的样子，为什么还会产生免疫呢？

🧬 艾克索太郎：谜就在这里。所以目光转向了容器。其实线索是有的。单凭没有装载mRNA的LNP，先天免疫也会立起来——这样的报告，在培养细胞和小鼠上都出过好几篇。给人单核细胞来源的树突状细胞加入空的LNP，就会有IL-1、IL-6、IL-12、干扰素α、干扰素γ这类细胞因子出来。本论文引用某篇综述，写道“61%引起了免疫应答”（不过被引文献数的是与脂质类纳米颗粒有关的研究报告，既不是LNP配方的61%，也不是接种者的61%。这里同样是追到被引文献就意思变了）。

更进一步的线索，来自共同作者 Alameh 等人的小鼠研究。空的可电离LNP的佐剂活性，部分依赖于 MyD88——MyD88是在TLR和IL-1受体下游工作的衔接分子，所以这提示有TLR参与其中。而在同一项研究中，去掉可电离脂质，细胞因子的产生就减少了。

为什么单说“空的LNP会刺激”还不够

到这里，“空的LNP会刺激免疫”已经大致清楚了。还缺的是经过哪个受体、驱动哪个转录因子、由哪个成分引起这样的通路定位。

而且先行研究之间互相矛盾。也有报告称，在小鼠模型中没有找到显示TLR参与的证据。要把这个矛盾理清，就需要在人的细胞里，把受体和衔接蛋白一个一个破坏掉来做比较。

测什么才算是答案

先天免疫这个开关的中枢，是两条系统的转录因子。

• NF-κB（nuclear factor-kappa B，核因子κB）——主管炎性细胞因子和趋化因子的产生
• IRF（interferon regulatory factor，干扰素调节因子）——主管I型干扰素的产生

TLR受到刺激后，会经由 MyD88 或 TRIF 这样的衔接蛋白，驱动这两条系统。

作者们用的是 THP-1-Dual 这种人单核细胞样细胞系。这是导入了两种报告系统的细胞：NF-κB一动，分泌型碱性磷酸酶（SEAP）就会出现在培养液里；IRF一动，分泌型荧光素酶就会出来。取培养液测颜色和光，开关打开的程度就变成了数字。

👦 学生：为什么是单核细胞呢？

🧬 艾克索太郎：单核细胞是在血液中巡逻的最前线的先天免疫细胞，对病原体和细胞损伤发出的信号反应很快。它也会聚集到打了疫苗的地方，是提呈抗原、把接力棒交给T细胞的那一侧的细胞。作为“最先与异物相遇的细胞”的代表，这是妥当的选择。不过，这是来自白血病患者的永生化细胞系，并不是活人身上的细胞。这一点后面会好好地批评。

这篇论文弄清了什么？

准备好的四个容器

比较的设计很清爽。作者准备了4种LNP。

四者都含有胆固醇、DSPC（辅助脂质）和PEG脂质。LNP-ALC315的PEG脂质是ALC-0159，LNP-SM102是PEG-DMG。对照使用了 R848（TLR7/8的激动剂）和 MPLA（TLR4的激动剂），此外还有TNFα（50 pg/mL）和干扰素α（5 ng/mL）。LNP全都以 1 µg/mL（按mRNA折算的量）给予。

① 单凭空的LNP，开关就打开了

NF-κB 在24小时就被检测到，48小时增加，到120小时基本持平。

• LNP-ALC315：24小时为未刺激对照的 2倍，48小时以后为 4倍
• LNP-1：48小时和72小时为 6〜7倍（最强）
• LNP-SM102：与LNP-ALC315相当

IRF 比NF-κB要克制一些。LNP-ALC315在48小时为 3倍，72小时为 1.7倍。LNP-1与LNP-ALC315相当，而结果是LNP-SM102显著更强。R848表现出最强的IRF应答。

不论哪种LNP，反应都是剂量依赖性的，在高剂量下达到平台（IRF在 2 µg/mL 达到平台）。

② 原因就是可电离脂质

这里是论文的核心。给予只去掉了可电离脂质的LNP之后，NF-κB应答和IRF应答都消失了。

👦 学生：四种脂质成分里只去掉一个，就变成零了吗？

🧬 艾克索太郎：是的。胆固醇也在、DSPC也在、PEG脂质也在，反应却立不起来。这是一个极其容易看懂的结果：可电离脂质就是刺激的来源。不过——这里必须老实说一句。被去掉的可电离脂质，是LNP的脂质当中占比最多的主成分（但本论文并没有记载自己配方的摩尔比——只写了成分名）。一去掉，剩下的就不是“只少了一个成分的同一种颗粒”，而是另一种颗粒。实际上这个对照的粒径是 80.26 nm，比 LNP-ALC315 的 54.07 nm 要大。我会在批判性检讨那一节再谈。

③ 通路是TLR4与MyD88

接下来要定位受体。作者们先从全面地看基因表达这一步切入。

他们把用LNP-1刺激24小时的THP-1细胞的RNA各取4个样本测序，判定出在检测到的57,773个基因中有10,585个是差异表达基因（错误发现率0.01，log2倍数变化大于1或小于−1）。

在NF-κB的亚基中，NFKB2（log2倍数变化 2.35）和 RELB（2.74）明显上升，NFKB1 也以 0.67 显著上升（略未达到基准）。在IRF中，IRF7（3.07）、IRF4（1.96）、IRF9（1.46）、IRF3（0.19）上升。这与报告基因实验的结果一致。

接着，基因集富集分析（GSEA）捕捉到了KEGG数据库中 Toll样受体信号通路 的上升。看这条通路里的基因，依次有 CD14（4.07）、CD86（2.96）、FOS（2.15）、JUN（1.93）、CD40（1.26）、STAT1（1.18）、MYD88（0.97）、TICAM1（0.77，编码TRIF）、TLR4（0.60）。在蛋白水平也得到了确认：流式细胞术显示 CD14和CD86增加到约2倍，CD40增加到1.3倍。

到这里，作者们进入正题：他们用的是把TLR4做了基因敲除的THP-1。

结果，所有可电离LNP的NF-κB应答和IRF应答都显著下降。不过，并没有完全变成零。作者们谨慎地写道：“TLR4是主要的受体，但其他通路也可能有贡献”。

做得周到的一点是，他们测了LNP里有没有混入内毒素，并确认低于检测限。内毒素（细菌的LPS）本来就是TLR4的配体，一旦混入，结果就全毁了。

衔接蛋白那一侧也被破坏了。在MyD88敲除中，3种LNP的NF-κB与IRF应答都下降。另一方面，在 TRIF敲除 中，LNP-1的NF-κB应答反而略有上升，LNP-ALC315和LNP-SM102虽然下降，但不及MyD88敲除那么明显。

🧬 艾克索太郎：也就是说，从TLR4到MyD88是主通路，TRIF的参与则因配方而异。还有一点，在不表达TLR4的 A549（人肺上皮细胞系）里，任何LNP都没有引起反应。

④ 事情发生在细胞表面，但需要血清

反应的时间点上有一个奇怪之处。信号转导通常在1小时左右就会走到转录因子的磷酸化，而LNP应答的峰值却在 48〜72小时。TLR激动剂在24小时之内就强烈立起来，LNP却慢。

作者们想：“是不是需要被摄取进去呢”。追踪用DiO这种荧光染料标记的LNP可以看到，摄取在2小时之内就能看见，到48小时达到最大。于是他们试了4种内吞抑制剂（Dynasore、细胞松弛素D、氯喹、甲基-β-环糊精）。

结果出人意料。只有氯喹降低了IRF应答，但抑制同一条网格蛋白依赖性途径的Dynasore却没有带来变化，因此氯喹的效果被判断为很可能是脱靶作用。

⚠️ 这里对论文的写法也要说一句。论文把氯喹介绍为“网格蛋白依赖性内吞（CME）的抑制剂”，但氯喹本来是溶酶体靶向性的药物，它的主要作用是阻止内体的酸化。它并不是一种能阻断CME本身的药。作者们“因为与Dynasore的结果不一致，所以大概是脱靶吧”这套论法本身是成立的，但药物分类的写法并不准确。总体来说，抑制剂对LNP的应答没有产生显著影响。

决定性的证据是定位。DiO标记的LNP与TLR4，在早期内体标志物Rab5a处并没有共定位。也就是说，与TLR4的相遇可以认为是发生在细胞表面。已知TLR4在表面用MyD88，内吞之后用TRIF，所以这与MyD88占优势的结果也是一致的。

不过作者们明确写道：“不能完全否定来自内体的信号转导”。因为抑制并不充分。

另一个发现是 血清的必要性。换成无血清培养基之后，NF-κB应答和IRF应答都显著下降了。

👦 学生：为什么需要血清呢？

🧬 艾克索太郎：论文举出了两种可能。一个是蛋白冠——血清蛋白在LNP表面形成一层，它帮助颗粒搭上受体。另一个是LPS结合蛋白（LBP），它本来就是把LPS递交给TLR4的中介角色。这篇论文并没有在两者之间做出判定。不过这个提示很重要：蛋白冠的组成会随周围环境改变，所以肌肉注射在体内形成的冠，和静脉注射形成的冠应该是不一样的。试管里的血清，和人的肌肉里的环境也不一样。这一点被明确列为今后的课题。

⑤ 而且加上mRNA，反应也没有增加

最后是这篇论文最出人意料的结果。

作者们原本预期“装载了mRNA的LNP反应应该更强”。可是实测之后，装有mRNA的LNP的反应，与对应的空LNP相当，甚至更低。表面CD86的表达也相当。由于R848确实给出了很强的反应，可见TLR7/8这条通路本身是活着的。即便如此，mRNA也没有带来额外的增加。

作者们的结论是这样的：“可电离LNP即使没有mRNA，也有能力完全激活单核细胞模型的先天免疫，而加入mRNA并没有使应答增加”。换句话说，BNT162b2疫苗中的主要佐剂就是LNP。

⚠️ 把这个结果读成“疫苗很危险”是错的

这里单设一节。这类结果很容易被错误引用，所以我来整理一下论文自己说了什么、又没有说什么。

第一，先天免疫的活化是疫苗起效的必要条件。所谓佐剂，正是为了这个目的才加进去的成分。TLR的激动剂在临床试验和已批准的疫苗中确实被当作佐剂使用。“LNP会引起先天免疫”不是在指出缺陷，而是在解释mRNA疫苗为什么没有佐剂也能起效。用作者们自己的话来说，目的是“获得改善未来疫苗的免疫原性和／或不良反应的洞见”。

第二，这是培养细胞系的实验。既没有动物实验，也没有人的数据。它也不是测量不良反应强度的研究。它不是一篇断定“不良反应的原因就是这个”的论文，而是一篇说“先天免疫活化的机制是这个，所以有调整的余地”的论文。

第三，被测量的LNP并不是市售疫苗本身。正如方法一节里写着“依照”配方制作那样，它们是在实验室里重做出来的东西。（请不要把粒径的数字当作根据。如后文所述，论文作为“市售品的数值”引用的 90.2 nm 与 75.5 nm，其实是另一项研究自己制作的LNP的数值。能作为根据的是方法部分的记述。）

第四，论文也老实地把相互矛盾的先行研究摆了出来。它明确写出存在这样的报告：在小鼠中缺失TLR4，疫苗的应答也没有丧失；以及MDA5才是关键的报告。它还写到，人和小鼠的TLR信号并不完全一致。

🧬 艾克索太郎：作为医生，我对这类话题的处理是谨慎的。这篇论文所展示的是“起效机制的一部分弄清楚了”。而一旦弄清楚，就可以去瞄准用更少的刺激给出同样效力的设计。作者们正在朝那个方向走。

未来会怎么改变？（通往临床的路）

“设计脂质来调节免疫”这条路

论文最明确展示的应用就是这一点：改变可电离脂质的结构，就能改变先天免疫刺激的强度。

依据有3点。第一，去掉可电离脂质，反应就消失了。第二，3种LNP的反应大小和模式各不相同——LNP-SM102的IRF最强，LNP-1的NF-κB最强，而LNP-ALC315则是NF-κB与LNP-SM102相当、IRF与LNP-1相当（论文的记述）。结构不同，反应就不同。第三，先行研究正在逐步锁定结构要素。按论文的引用，有报告称可电离脂质的胺头部结构通过与TLR4以及CD1d的结合左右免疫应答（Nature Biomedical Engineering 2024年第8卷第1483页），也有报告称阳离子脂质头部基团的差异会调节TLR4信号。

🧬 艾克索太郎：作者们把这件事比作：细菌的种类不同，LPS的结构也不同，TLR4信号的强度也随之改变。自然界里存在从“强TLR4配体”到“弱TLR4配体”的一段连续谱。那么脂质也应该可以选择瞄准这段谱上的哪个位置——这就是他们的想法。

由此导出的配方战略有两个方向。想提高佐剂活性的话——比如在免疫应答不容易立起来的老年人和婴幼儿身上，或者在肿瘤疫苗里——就选强的可电离脂质。想压住不良反应的话就选弱的。意思是，如今几乎只按“递送效率”这一个维度来挑选的脂质，今后也能按免疫学的维度来挑选。

“与其动mRNA，不如动脂质更有效”

论文最后一句话所指示的方向转变也很重要。作者们这样写道：既然先天免疫活化的主要驱动因素是LNP而不是RNA，那么与其进一步修饰mRNA，更应该把力气投向理解如何制造能瞄准特定信号通路的LNP。

mRNA那一侧的优化（修饰核苷、纯化、UTR、密码子）已经推进得相当远了。而这篇论文说的是，剩下的提升空间在容器那一侧。

把两篇论文叠起来能看见什么

这里，我们把同日发布的另一篇——说LNP的77%都是空载的那篇2022年 Nature Communications 论文——叠起来看看。

那一篇测出“装载了mRNA的颗粒只占整体的23%”。这一篇测出“单凭空的颗粒，先天免疫就完全立起来，加上mRNA也不会增加”。直接叠起来，就得到这样一幅图景：接种的一剂疫苗的佐剂活性，大半是由一条mRNA也没装的颗粒承担的。

👦 学生：这是从这两篇论文就可以说出来的结论吗？

🧬 艾克索太郎：只能说一半。作为逻辑它看起来很自然，但有两点要注意。第一，测量空载率那篇论文的可电离脂质是 DLin-MC3-DMA，不是这一篇的 ALC-0315／SM-102。空载率在不同配方之间如何不同，并没有被测量过。第二，按本次论文“按mRNA折算 1 µg/mL”这种统一剂量的做法，空的LNP与装有mRNA的LNP之间脂质总量是如何对齐的，从正文里没法完全追查清楚。所以说到“有所提示”为止才是正确的说法。

即便如此，作为提问我觉得很锐利。减少空载的制剂改良，也许会提高递送效率，但同时也许会降低佐剂活性。这两个指标有可能成为此消彼长的权衡。能注意到这种可能性，是因为把两篇并排读了。

到临床还有多远

我直说。这篇论文没有通往临床的直接桥梁。它是细胞系的实验。动物身上的不良反应、人的耐受性、与免疫持续时间的关系，全都未经验证。即便如此，“应该去调的旋钮”被定位出来了，这件事是有意义的。要是连旋钮在哪都不知道，那也转不了。

该怎么批判性地读这项研究（局限，以及进一步提高质量的路）

值得肯定的地方

我公平地写。比较的设计是正确的。在同样的细胞、同样的剂量、同样的时间点上，把3种真实存在的LNP配方与“去掉可电离脂质的那一种”并排放在一起。他们是靠破坏基因来确认的——用分别敲除了TLR4、MyD88、TRIF的细胞系，比依赖抑制剂是强得多的证据。测了内毒素的混入并加以排除，这在讨论TLR4时是必需的工作，而省掉这一步的论文并不少。从全面分析出发立下假说，用单个基因的破坏来验证，再在蛋白水平取得旁证，这个顺序也很干净。否定性的结果也没有藏起来——TRIF敲除时LNP-1的NF-κB反而上升、破坏TLR4后反应也没有完全消失、内吞抑制并不具有决定性、存在相互矛盾的先行研究，这些他们全都写了。而且他们公开了序列数据。

读的时候想留点心的地方

① 让一个细胞系承担了太多。主要结论全都出自 THP-1，也就是来自急性单核细胞白血病患者的永生化细胞系。作为辅助使用的 A549 也是来自肺癌的细胞系。既没有人的原代单核细胞或单核细胞来源树突状细胞的数据，也没有动物实验。细胞系的受体表达量和信号阈值都与活体细胞有偏差。这是与“可以做敲除”这个巨大优点的交换，但要一般化到“在人的先天免疫细胞里”，还差一截。

② 无可电离脂质的对照是另一种颗粒。我再说一遍，这是最大的混杂因素。可电离脂质是LNP的脂质当中占比最多的主成分（本论文没有记载摩尔比，所以到底去掉了多少，从论文里是看不出来的）。去掉之后的颗粒粒径是 80.26 nm（对照的LNP-ALC315是 54.07 nm），Zeta电位是 −8.548（对照是 −4.447。论文是不带单位记载的。按惯例应是 mV），大小和表面电荷都不一样。被摄取的方式、稳定性、蛋白冠都应该会改变。因此，“反应消失了”这件事并不说明“可电离脂质是配体”，而只停留在说明“不是含有可电离脂质的颗粒就不会反应”。虽然有支持作者们的独立证据（胺头部结构左右TLR4结合的先行研究），但单凭这篇论文，并没有展示出脂质分子本身结合到了TLR4上。要是有把用量阶梯式减少的实验，或者换成形状相似的非可电离脂质的实验，主张就会强得多。

③ 颗粒性状的描述偏弱。粒径、PDI、Zeta电位都是每个条件只有单一数值，而且像 LNP-SM102 的 51.590 nm 或 LNP-ALC315 的Zeta电位 −4.447 这样，连没有意义的位数都写了出来（Zeta电位没有带单位）。重复测定和SD没有被报告（究竟是没有做，还是只是没有报告，从论文里无法区分）。此外，LNP-1 和 mRNA-LNP-1 的粒径没有被报告。而且，这里还有一处追到被引文献就会崩塌的比较。本论文的引言，把 BNT162b2 和 mRNA-1273 的“疫苗的LNP”的粒径引作 90.2 ± 7.8 nm 和 75.5 ± 0.4 nm（被引文献是 Zhang L 等, npj Vaccines 2023;8:156）。可是去读那篇被引文献，被测量的并不是市售疫苗本身。那是该研究自己制作的、装载了萤火虫荧光素酶mRNA的LNP的数值，脂质的摩尔比也是 50:10:38.5:1.5。被引文献自己就明确写道：“这些LNP的组成与辉瑞／BioNTech或莫德纳的疫苗并不相同”。

也就是说，把本研究的 54.07 nm 和被引用的 90.2 nm 并排放在一起，那也只是重构物之间的比较，并不能证明“与市售品不同”。这处错误归属在本论文这一侧，我自己最初也是照着它接受下来的。另外，“被测量的是参照配方的重构物，而不是市售疫苗本身”这个事实本身，从方法部分的记述（“依照”配方制作）来看依然成立——只是依据不是粒径的数字而已。

④ 所用mRNA的修饰状态没有写在方法里。这关系到主张的核心，所以我具体指出来。方法一节里写了：它编码SARS-CoV-2奥密克戎株刺突蛋白（S2P），用CleanCap在转录的同时加帽，用纤维素层析纯化，用斑点印迹确认双链RNA已被去除，并测了内毒素（低于0.05 EU/mL）。但是，有没有做N1-甲基假尿苷修饰，没有写。论文的引言把“现行疫苗的mRNA是经过修饰的”当作论述的出发点，那么自己的mRNA有没有经过修饰，就是本质性的信息。如果是未修饰的，那就意味着连本该更容易产生刺激的mRNA都没有带来额外增加，这对作者们有利；但如果是已修饰的，也可以读成“多亏了修饰才安静”。读者被置于无法选择解释的状态。

⑤ 与装有mRNA者的比较是有限的。做成装有mRNA的LNP的，只有 LNP-1 和 LNP-ALC315 这2种，没有 mRNA-LNP-SM102。比较只在72小时这一个时间点。“mRNA不会带来额外增加”这个结论的射程，就停在这个范围里。另外，作者们自己在解释与使用GMP生产的BNT162b2的先行研究（主张MDA5是关键的报告）之间的分歧时，举出的理由是自己的mRNA是纤维素纯化品。也就是说，作者们也承认，mRNA的制作方式可能会改变结果。

⑥ 有正文与他们自己的表格互相矛盾的地方。关于IRF，作者们写道：“上升的IRF当中，满足差异表达基因基准的只有IRF4和IRF7”。可是同一张图的表格里，却载有 IRF9 的 log2倍数变化 1.46、校正p值 3.3 × 10⁻⁵⁸。这明确地满足作者们自己的基准（log2倍数变化大于1、错误发现率0.01）。这不是会改变结论的错误，但要引用数字的读者需要去看表格。

⑦ 统计的记载不一致。统计分析一节里只写了单因素方差分析（Dunnett或Tukey），可图的说明文字里却还用了 t检验。图4的说明文字写着“显著性用t检验（A）或单因素方差分析与Dunnett多重比较（A, B）或Student t检验（C）评估”，给面板A分配了两种不同的检验。读者无法知道某个数值是用哪一种算出来的。此外，在图2和图4的说明文字里，第4级显著性水平的星号印成了3个（***P ≤ 0.001, ***P ≤ 0.0001）。这是校对上的疏漏。

⑧ n = 3 的内容没有被定义。方法里写着“对每个条件都实施了生物学重复和技术重复”，图的说明是 n = 3。这个3究竟是独立的生物学重复，还是来自同一培养的技术重复，读不出来。此外，数据是用标准误（SEM）而不是标准差来表示的，所以离散程度看起来很小。

⑨ 细胞死亡的混杂还留着。作者们老实地写了——所有条件下存活率都下降，而且48小时时LNP-1引起了最强的细胞死亡，这与最强的NF-κB活化相对应。将死的细胞释放出的物质（DAMPs）能够敲打TLR4，所以我们看到的究竟是“LNP带来的刺激”，还是“LNP引起的细胞死亡所带来的二次刺激”，在原理上没法完全分开。作者们以LNP-SM102 引起了同等程度的细胞死亡，却在这个时间点上几乎没有驱动NF-κB，以及脂质结构会结合TLR4的先行研究为依据，论证这是与细胞死亡不同的另一条通路。有说服力，但还没有定论。

⑩ 报告酶测的是累积值。SEAP和荧光素酶都是会在培养液里不断积累的分泌酶。测到的不是瞬间的信号强度，而更接近到那个时点为止的产生总量。“LNP的应答在48〜72小时达到 peak，比TLR激动剂慢”这个观察很有意思，但它也是摄取逐渐推进、细胞不断增多、酶不断积累这几件事混在一起的结果。要是有用磷酸化这类直接指标把时间进程按住的实验，关于动力学的讨论就会结实得多。

⑪ 没有测量细胞因子的蛋白。这篇论文的输出是报告酶、表面标志物和转录本。IL-6、IL-1β、干扰素实际出来了多少，并没有被测量。作为讨论不良反应和耐受性的地基，这里是空着的。

⑫ LNP-1 是专有配方。表现出最强NF-κB应答、而且也被选为转录组分析的模型的LNP-1，其组成除了专利的记载之外并未公开。第三者只凭论文的记载很难重现，而且它也不是已批准疫苗的配方。把专有配方立为讨论机制普遍性的支柱，即便有不得已的缘由，也是弱点。

⑬ 细节上，单位的标注有错误。第7个单位写成了“Uniformed Services University of Health Sciences, Bethesda, PA”，但贝塞斯达在马里兰州（MD）。其他单位的标注写的都是MD。

怎样才能让这项研究的质量更高

• 在人的原代细胞上重现。用外周血的单核细胞或单核细胞来源的树突状细胞，至少确认主要结论（对可电离脂质的依赖、对TLR4的依赖、mRNA没有额外增加）。不能做敲除的部分，用中和抗体或抑制剂来补
• 不是把可电离脂质“去掉”，而是“减少”它、“替换”它。用阶梯式的剂量反应，或者换成形状相似的非可电离脂质，把颗粒层面的性质对齐之后再比较。在现在这个对照里，分子的贡献和颗粒的贡献分不开
• 把颗粒的性状带上重复测定，对全部配方都加以报告。有效数字也要与实际相符。与市售品的差异也要明确地讨论
• 明确写出mRNA的修饰状态。如果可能，把修饰mRNA和未修饰mRNA并排比较，也与GMP生产品相比。这样就能定位出与先行研究分歧的原因
• 用蛋白来测细胞因子。只有报告基因和转录本，接不上不良反应和耐受性的讨论
• 在动物身上一直追到不良反应的指标。“改变脂质结构就能调节刺激”这个最大的主张，最终需要在活体的耐受性和免疫原性两方面都展示出来
• 对数值、统计、图表的记载做机械式的核查。IRF9的矛盾、检验的重复记载、星号的误印、州名的错误，用投稿前的检查清单就能消掉

艾克索太郎的视角

容器不只是用来运送内容物的箱子

我老实说。疫苗学并不是我的专业。我所从事的，是用间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）以及从它分泌出来的细胞外囊泡（extracellular vesicle, EV），来治疗脊髓损伤等神经疾病。我也没有处理过TLR4敲除细胞系的经验。

即便如此我还是选了这篇论文，是因为这里写的东西会扎在我们这个领域的正中心。

把这篇论文的教训归成一行，就是“容器不只是用来运送内容物的箱子。容器本身就具有生物活性”。而我们这个领域，处理的恰恰就是这一行。

在说明MSC-EV的治疗效果时，我们大多谈的是内容物。说这个 miRNA 会抑制炎症，这个蛋白质会帮助轴突延伸。可是EV是由脂质双分子层构成的颗粒，膜里埋着四跨膜蛋白和整合素，表面覆盖着一层蛋白质。那层膜和那个表面，不可能对接收它的细胞什么都没做。

尤其是人们对 MSC-EV 期待的主要效果——免疫调节与抗炎——按其性质来说，并不一定是把内容物送进细胞质之后才发生的事。它有可能从颗粒接触到细胞表面受体的那一瞬间就已经开始。也就是说，在我们这个领域，“容器的生物活性”也许不是副作用，而正是我们所期待的主作用本身。

这篇论文用合成颗粒这样一个简单的体系，借助敲除细胞，把这件事干净地展示了出来。去掉一个成分，反应就消失了；破坏受体，反应就下降了。当我们在EV上提出同样的问题时，能回答得这么干净吗？要从EV里只把“那一个成分”抽掉，并不简单。

TLR4在脊髓损伤的现场是主角之一

这是对我来说最具体、也最让我挺直脊背的一点。

TLR4是处在脊髓损伤后病理中心的受体。受损的组织会释放出来自破碎细胞的内源性分子（DAMPs），它们经由小胶质细胞和巨噬细胞的TLR4驱动炎症反应。这个反应既朝着扩大二次损伤的方向起作用，同时也朝着清理瓦砾和修复所必需的方向起作用——它不是单纯的“坏人”，其意义会随强度和时机而改变，是一条难以处理的通路。

把这篇论文的结果叠到这上面：含可电离脂质的LNP，经由TLR4激活先天免疫。

🧬 艾克索太郎：如果我要用LNP把mRNA或siRNA送到受损的脊髓里，那意味着我在做什么呢。那意味着，往一个已经因TLR4信号而炎症奔流的组织里，灌进去敲打TLR4的颗粒。

这是我从这篇论文得到的推论，并不是论文所展示的内容。论文完全没有涉及中枢神经，而且它说的是培养细胞系。局部给药和全身给药，蛋白冠也好、到达的细胞种类也好，都完全不同。所以，绝不能说出“LNP不能用于脊髓损伤”这样的话。在损伤部位，适度的先天免疫刺激反而有益的局面大概也是有的。

即便如此，不能只凭“递送效率好”这一个理由来挑选运输工具——这一点我觉得是一定要带回去的。运输工具的免疫学性质，会与送达对象组织的状态相乘。是送到炎症奔流的组织，还是送到安静的组织，同一个运输工具的评价就会改变。

那么，把EV用作运输工具的理由会变强吗

这一节我要写得不顺着诱惑走。

“EV是生物体来源的，所以在免疫学上很安静，比LNP安全”——很容易想这么说。实际上，EV里确实没有合成的可电离脂质。但这个推论很危险。没有证据表明EV在免疫学上是不活跃的。EV表面有多种多样的分子，内容物和表面都会随供体细胞的状态而改变。如果是异体的EV，被提呈的分子也可能成为问题。“没有合成脂质”这件事，并不等于“不刺激免疫”这件事。

这篇论文促使我去做的，反而是方向相反的工作：在把EV作为运输工具来评价时，应该从一开始就测量它的免疫学性质。不只是递送效率和内容物的分析，还要像这篇论文所做的那样，在同样的水准上去看它触到哪个受体、驱动哪个转录因子。

关于写法

最后再说一点。在这篇论文里我最信任的，是他们把对自己的结论不利的事情写进了正文这一点。

他们写：破坏TLR4之后反应也没有完全消失。他们写：内吞抑制没有给出定论，不能否定来自内体的信号。他们写：有配方在破坏TRIF之后反而上升了。他们自己提出细胞死亡混杂进来的可能性。他们还写到：有报告称在小鼠中缺失TLR4应答也没有丧失，有报告称MDA5才是关键，以及人和小鼠的TLR并不完全一致。然后他们自己加上保留：“要给出决定性的IRF活化证明，还需要进一步的检讨”。

不把测到的事情和推测的事情混在一起。而且，把对自己假说不利的先行研究，放在正文而不是脚注里介绍。我觉得这是一篇主张机制的论文应有的态度。

※本文在人工智能的协助下撰写。