إعطاء «عنوان» للجسيمات النانوية الدهنية (LNP) الناقلة للأدوية: لا بلصقه على السطح، بل بإقحامه لاحقًا. قبل الديلزة أم بعدها؟ هكذا تغيّر مصير الجسيم

اكتسبت الجسيمات النانوية الدهنية (lipid nanoparticle, LNP) شهرة واسعة مع لقاحات mRNA المضادة لكوفيد-19. وهي عربات نقل تغلّف RNA الهشّ داخل كريّة دهنية وتوصله إلى داخل الخلية. وبما أنّ اللقاح يُحقن في العضل ويكفي أن يعمل في موضع الحقن والعُقَد اللمفية المجاورة، لم يكن سؤال «إلى أين نوصّل؟» مطروحًا بإلحاح.

لكنّ الأمر يختلف حين نريد استهداف نوع واحد من الخلايا. فالجسيمات التي تُطلق في مجرى الدم تتجمّع في الكبد إن تُركت لحالها. وإذا أردنا تحديد المُرسَل إليه — خلايا ابيضاض الدم وحدها، أو الخلايا العصبية وحدها — فلا بدّ من تثبيت «عنوان» على سطح الجسيم، أي ربيطة (ligand) أو جسم مضاد يرتبط بالهدف.

الورقة التي نتناولها اليوم تتصدّى لمسألة واحدة بعينها: كيف نثبّت هذا العنوان. قد يبدو الموضوع متواضعًا، لكن لا معنى لتثبيت عنوان إذا كانت العملية نفسها تُهشّم الحزمة التي نريد إرسالها. وهذا تحديدًا ما قاسته الورقة.

ولنضع تحذيرَين في البداية. أولًا، هذه ورقة من عام 2022. وسبب تناولها الآن أنّها الأساس الذي قامت عليه تجارب الحيوان التي نشرتها المجموعة نفسها في 2023 (سنعود إليها)، وأنّ الأسلوب المستخدم فيها يتّصل اتصالًا مباشرًا بتعديل سطح الإكسوسومات. ثانيًا، هذا بحث داخل الخلايا وأنابيب الاختبار، وليس حديثًا عن علاج متاح للمرضى.

معلومات النشر

• عنوان الورقة: A robust post-insertion method for the preparation of targeted siRNA LNPs (طريقة post-insertion متينة لتحضير جسيمات LNP موجَّهة حاملة لـsiRNA)
• نوع الورقة: بحث أصلي (دراسة منهجية في الصيدلة الصناعية وتوصيل الأدوية)
• المجلة: International Journal of Pharmaceutics، المجلد 620، رقم المقال 121741 (وردت في 1 فبراير 2022، قُبلت في 8 أبريل، نُشرت إلكترونيًّا في 11 أبريل)
• DOI / الرابط: 10.1016/j.ijpharm.2022.121741
• الترخيص: وصول مفتوح (CC BY 4.0). النصّ الكامل متاح للجميع
• Impact Factor: نحو 5 تقريبًا (يتغيّر من سنة إلى أخرى. وهي مجلة متخصّصة عريقة في مجال الصيدلة الصناعية وتوصيل الأدوية)
• المؤلفون: L.E. Swart (المؤلفة الأولى)، C.A. Koekman، C.W. Seinen، H. Issa، M. Rasouli، R.M. Schiffelers، O. Heidenreich (المؤلف المسؤول) — 7 مؤلفين
• الانتماءات: مركز الأميرة ماكسيما لأورام الأطفال (أوترخت، هولندا)؛ قسم الكيمياء السريرية وأمراض الدم في مركز جامعة أوترخت الطبي (UMC Utrecht)؛ مركز وولفسون لبحوث سرطان الأطفال بجامعة نيوكاسل (المملكة المتحدة)؛ قسم طب الأطفال في مستشفى جامعة فرانكفورت (ألمانيا)
• التمويل: منحة برنامجية من منظمة KiKa الهولندية الداعمة لبحوث سرطان الأطفال (grant 329)
• الإفصاح عن تضارب المصالح: المؤلف المسؤول Heidenreich لديه طلب براءة اختراع قيد النظر بعنوان «Targeted lipid nanoparticle formulations» (صِيَغ جسيمات نانوية دهنية موجَّهة)، وبحسب نصّ الورقة فإنّ الطلب مُقدَّم بما يعود إلى مركز الأميرة ماكسيما لأورام الأطفال

مَن هو المؤلف المسؤول؟

المؤلف المسؤول Olaf Heidenreich قائد مجموعة بحثية في مركز الأميرة ماكسيما لأورام الأطفال، وأستاذ أمراض الدم الجزيئية وقائد محور بحوث سرطان الأطفال في جامعة نيوكاسل بالمملكة المتحدة. ومحور عمله ثابت لم يتغيّر: كيف نضرب «الجين الاندماجي» الناتج عن تبادل أجزاء الكروموسومات في ابيضاض الدم. وعلى رأس ذلك RUNX1/ETO (ويُكتب أيضًا RUNX1/RUNX1T1 أو AML1/ETO) الناشئ عن الانتقال الكروموسومي t(8;21)، وقد تتبّعه أكثر من 20 عامًا. وفي 2003 نشر في مجلة Blood ورقة تبيّن أنّ كبت AML1/MTG8 (أي RUNX1/ETO) بواسطة siRNA يدفع خلايا الابيضاض الموجبة لـt(8;21) نحو التمايز النقوي.

الجين الاندماجي هدف مثالي لأنّه لا يوجد إلا في الخلية السرطانية، لكنّه في الوقت نفسه خصم يصعب إصابته بالأدوية الجزيئية الصغيرة التقليدية (فمن المعروف عمومًا أنّ البروتينات الناتجة عن اندماج عوامل نسخ لا تحتوي جيبًا عميقًا يمكن للدواء أن ينغرس فيه). وهنا تبرز قوة siRNA التي تستهدف بحسب التسلسل. لكن إيصال هذا الـsiRNA يحتاج إلى عربة نقل — وهذه الورقة هي العمل الذي يُعِدّ تلك العربة.

أمّا المؤلف المشارك Raymond M. Schiffelers (المسؤول في هذه الورقة عن التصوّر العام والإشراف) فهو أستاذ الطب النانوي في UMC Utrecht. وهنا مفتاح الموضوع، فلنتوقّف عنده قليلًا. كان بحثه للدكتوراه (جامعة إيراسموس روتردام، 1996–2001) عن «توجيه المضادات الحيوية بالليبوزومات»، أي إنّه باحث نشأ في عالم الليبوزومات. وفي 2010 حصل على منحة ERC عن «أنظمة توصيل الأدوية المستوحاة من الحويصلات الدقيقة»، وهو عضو مؤسِّس في الجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلوية (International Society for Extracellular Vesicles, ISEV) ونائب رئيس تحرير Journal of Extracellular Vesicles. أي أنّ شخصًا يقف في قلب عالم الحويصلات خارج الخلوية شارك من مرحلة التصوّر في ورقة صيدلانية عن LNP، وهو جسيم نانوي اصطناعي. لكن لا بدّ من التنبيه: الورقة نفسها لا تذكر الحويصلات خارج الخلوية ولا مرّة واحدة. فالمقارنة فيها بين الليبوزومات وLNP. ومع ذلك فإنّ تشكيلة المؤلفين التي تجمع هذه الجسيمات الثلاثة سترتبط بما سنقوله في الجزء الأخير.

والمؤلفة الأولى Laura E. Swart هي من وضعت الطريقة وأجرت التجارب والتحليل وكتبت المسوّدة، ويظهر اسمها أيضًا في ورقة المتابعة لعام 2023 التي سنعرض لها لاحقًا.

ما الذي لم يكن معروفًا حتى الآن؟

الليبوزومات وLNP: متشابهان في الظاهر، مختلفان في الداخل

أقدم الجسيمات النانوية المستخدمة في تغليف الأدوية هو الليبوزوم (liposome). وهو كيس من الغشاء الدهني المزدوج (lipid bilayer) المماثل لغشاء الخلية، وجوفه ماء. وقد استُخدم في العيادات منذ عقد 1990.

أمّا LNP الذي ينقل siRNA فبنيته مختلفة. فبحسب الورقة، داخل LNP عبارة عن لبّ شبه كاره للماء بالكامل، تحتشد فيه مذيلات دهنية مرتَّبة بشكل معكوس، وهذه المذيلات هي التي تغلّف الحمض النووي. فهو ليس كيسًا مملوءًا بالماء، بل كريّة مكتنزة بما فيها. وبالفعل تُظهر صور المجهر الإلكتروني في هذه الورقة جسيمات LNP ككُرات داكنة مكتنزة من الداخل.

👦 طالب: إذا كان كلاهما «كريّة دهنية»، فلماذا لا نتعامل معهما بالطريقة نفسها؟

🧬 إكسوتارو: هنا المَزلق بالضبط. تصوّر الليبوزوم بالونًا، وتصوّر LNP كعكة محشوّة بعجينة كثيفة. غرز زينة في غشاء البالون شيء، وغرزها في سطح الكعكة شيء آخر تمامًا — يختلف شكل الغرز، ويختلف أيضًا نمط التفتّت الذي يليه.

تثبيت العنوان على الليبوزومات عملية راسخة ومعروفة. فإذا أضفنا إلى الربيطة ذيلًا دهنيًّا، انغرس هذا الذيل تلقائيًّا في الغشاء المزدوج. لكنّ LNP لا يملك غشاءً مزدوجًا ينغرس فيه الذيل. وهذه هي نقطة انطلاق الورقة.

وهناك شرط آخر يجب حفظه: القُطر الهيدروديناميكي للجسيم. وتستشهد الورقة بدراسات سابقة فتسمّي المجال 40〜150 nm «منطقة غولديلوكس». فما كان أصغر من ذلك ترشّحه الكلى، وما كان أكبر منه لا يستطيع النفاذ إلى الأنسجة. فالحجم ليس مؤشّرًا ثانويًّا، بل شرط يحدّد ما إذا كان الجسيم قابلًا للاستخدام أصلًا.

أيُّ الطريقتين أفضل؟

قارنت الورقة بين الطريقتين التاليتين (الشكل 1 في الورقة).

1. التعديل السطحي المباشر — نُصنّع الجسيم أولًا، ثم نربط الربيطة مباشرةً بالمجموعات التفاعلية البارزة على سطحه (الشكل 1A)
2. post-insertion (الإقحام اللاحق) — نربط الربيطة بالدهن مسبقًا لتكوين قطعة واحدة، ثم نُقحم هذه القطعة في الجسيم بعد اكتماله (الشكل 1B)

وللربط اختار الباحثون تفاعل النقر (click reaction)، وتحديدًا النوع الذي لا يستخدم النحاس. واسمه الرسمي الإضافة الحلقية بين الأزيد والألكاين المعزَّزة بالإجهاد (strain-promoted azide-alkyne cycloaddition, SPAAC).

👦 طالب: ولماذا نتجنّب النحاس؟

🧬 إكسوتارو: النحاس (I) محفّز ممتاز، لكنّه سامّ للكائنات الحية. ولهذا يُستخدم ألكاين حلقي مُجهَد عن قصد، وهو DBCO. فالإجهاد يرفع طاقته، فيتفاعل مع الأزيد من تلقاء نفسه دون أي محفّز. اضغط المِشبك فيُطبِق بصوت «كليك» — ومن هنا جاء اسم تفاعل النقر.

ويبقى المتغيّر الأخير: التوقيت. فبعد تصنيع LNP تأتي مرحلة إزالة الإيثانول بالديلزة (dialysis). والديلزة لا تُزيل المذيب فحسب، بل تُعادِل الشحنة السطحية وتُثبّت ترتيب الدهون، أي إنّها تُنضِج الجسيم. فهل نثبّت العنوان قبل هذه الديلزة أم بعدها؟ لم يدرس أحد هذا السؤال بشكل منهجي.

ما الذي كشفته هذه الورقة؟

طريقة التحضير — المواد والخطوات

يُصنَع LNP الأساس بإذابة خمسة مكوّنات في الإيثانول: DLin-MC3-DMA (دهن قابل للتأيّن)، DSPC، الكوليسترول، DMG-PEG(2000)، DSPE-PEG(2000)-DBCO، بنسبة مولية 50:10:38.5:1.2:0.3. وعند إجراء post-insertion تغيّرت النسبة إلى 50:10:38.5:1.5:0.1 لإتاحة مجال للإقحام.

ويُخفَّف siRNA في حمض أسيتيك بتركيز 25 mM (pH 4) ليُضبط على نسبة N/P تساوي 4، ثم يُمزج في جهاز ميكروفلويدي يُسمّى NanoAssemblr Benchtop بمعدّل تدفّق كلي 4 ml/min ونسبة تدفّق دهن:siRNA تساوي 1:3. وبعد ذلك تُجرى الديلزة مقابل PBS عبر غشاء بحدّ قطع 10 kDa عند 4 ℃ طوال الليل، فيُزال الإيثانول ويحدث التعادل.

والحمولة من siRNA نوعان: siRE هو المقصود فعلًا، إذ يستهدف نقطة الاندماج في RUNX1/ETO؛ أمّا siMM فهو شاهد غير متطابق تبدّلت فيه قاعدتان. واستخدام شاهد يختلف عن الأصل في تسلسله اختلافًا طفيفًا تصميم أساسي يهدف إلى إثبات «أنّ التسلسل هو الذي أدّى المفعول» لا مجرّد «أنّ الجسيم دخل الخلية». أمّا تحضير قطعة العنوان فيجري بنسبة مولية DBCO:أزيد = 3:1، في حرارة الغرفة طوال الليل. والقطعة الناتجة استُخدمت فعليًّا بعد حفظها عند 4 ℃ مدة تصل إلى 7 أيام (دون أن يكون ذلك قد خضع للتحقّق كمدة صلاحية للتخزين).

① الربط المباشر على السطح يُفكّك الجسيم

هذه أوضح نتيجة في الورقة. قارن الباحثون 4 شروط من ناحيتَين معًا: الحجم المقيس بتشتّت الضوء الديناميكي (dynamic light scattering, DLS)، والمظهر المرئي في المجهر الإلكتروني البردي (cryoEM).

(المتوسط ± الانحراف المعياري، n = 3. وPDI هو معامل تعدّد التشتّت؛ كلّما اقترب من 0 كانت الجسيمات أكثر تماثلًا في الحجم)

وصور cryoEM تشرح معنى هذه الأرقام. في A تصطفّ كُرات مكتنزة في نظام بديع، وفي B حُفظت بنية اللبّ أيضًا. أمّا في C — أي الربط المباشر على السطح — فقد انهار الشكل الكروي وظهرت شُدف مذيلية، بل ظهرت كذلك جسيمات كبيرة متعدّدة الأغشية يُرجَّح أنّها نتجت عن اندماج عدة جسيمات LNP (الدوائر البيضاء في الشكل 2C من الورقة). في المقابل حفظ D شكله الكروي ولبَّه المكتنز.

👦 طالب: الحجم عند الشرط B بلغ 110 nm بالفعل. لم نُضف سوى DBCO، فلماذا يتضخّم الجسيم؟

🧬 إكسوتارو: تخمين الورقة كالتالي. عندما لا يكون DBCO مرتبطًا بالأزيد، تنقلب مجموعته لتتوجّه نحو داخل الجسيم. وقد سجّلت دراسات سابقة أنّ PEG ينغمس داخل الجسيم أثناء التجمّع الذاتي، ويُرجَّح أنّ الأمر هنا من النوع نفسه. أي إنّنا سنحاول تفاعلًا من الخارج مع مجموعة انقلبت إلى الداخل. ولهذا يكون «الربط أولًا ثم الإقحام» أكثر استقامة منطقيًّا، مع أنّ الورقة لم تقِس الآلية بما هو أبعد من ذلك.

ولم يكن هذا الاتجاه متوقّفًا على نوع الربيطة ولا على نوع الحمولة. فالبيانات التكميلية التي استُبدلت فيها الربيطة بجسم نانوي VHH والحمولة ببار كود من DNA أعطت النتيجة نفسها، وأبقى post-insertion زيادة الحجم دون 50%.

② الحجم يتغيّر بحسب ما إذا كان الإقحام قبل الديلزة أو بعدها

ننتقل الآن إلى تغيير التوقيت. استُخدمت جسيمات LNP موسومة بالصبغة الفلورية Cy3، وأُعدّت منها سلسلتان تختلفان في كمية PEG (DMG-PEG بنسبة 1.5% ثم 1.2%).

(المتوسط ± الانحراف المعياري، n = 3. وقيم p محسوبة باختبار t لستيودنت ثنائي الطرف. ولا توضّح الورقة أيّ مقارنة تعبّر عنها هذه القيم، لكن خلوّ خانة صفّ «بعد الديلزة» يُفهم منه أنّ هذا الصفّ هو المرجع في المقارنة)

والاتجاه واضح. الإقحام قبل الديلزة يرفع الحجم إلى ما يتجاوز 100 nm بكثير، والإقحام بعدها يعطي أصغر حجم. وقد لخّصت الورقة ذلك بقولها إنّ «لحظة إزالة المذيب كانت حاسمة».

وظهر فرق مرتبط بكمية PEG أيضًا. ففي سلسلة 1.2% ارتفع PDI من 0.136 إلى 0.246 حتى مع الإقحام بعد الديلزة، أمّا في سلسلة 1.5% فقد انتقل من 0.147 إلى 0.161، أي إنّه لم يتحرّك تقريبًا. وتناقش الورقة ذلك بأنّ LNP قليل PEG غير مستقرّ في الأصل وسريع التكتّل، فيتجمّع أثناء عملية post-insertion. ولهذا اعتمد المؤلفون 1.5% معيارًا فيما تلا. لكن خانة قيم p تحتاج إلى حذر. فمقارنات سلسلة 1.5% لم تبلغ أيٌّ منها مستوى الدلالة. وسنعود إلى هذه النقطة في الجزء الأخير.

👦 طالب: وما الذي يقيسه رقم PDI تحديدًا؟

🧬 إكسوتارو: إنّه مدى تماثل الجسيمات في الحجم. فكلّما اقترب من 0 كانت الجسيمات متساوية الحجم، وكلّما كبر كانت متفرّقة متباينة. وفي علم الصيدلة الصناعية يُعَدّ بأهمية الحجم المتوسط نفسها، لأنّ مجموعة مختلطة من الكبير والصغير يصعب التنبّؤ بسلوكها داخل الجسم، كما أنّها غير مستقرّة من حيث الجودة.

③ التفاعل ينجح في أي درجة بين 25〜55 ℃ وينتهي في 30 دقيقة

في الليبوزومات، أُفيد أنّ كفاءة post-insertion تتوقّف بشدّة على الحرارة وتتحكّم فيها درجة الانتقال الطوري للدهن. فماذا عن LNP؟

جسيمات LNP محمّلة بـsiRNA موسوم بـCy5 تُفاعَل مع قطعة موسومة بـCy3 عند 25 و35 و45 و55 ℃، بواقع 2 ساعة لكل درجة. والبراعة هنا في أنّ صبغة siRNA وصبغة القطعة المُقحَمة مختلفتان إحداهما عن الأخرى. ولتقييم الكفاءة استُخدم الانسلال المشترك في FPLC. فعلى عمود Sepharose CL-4B يخرج LNP الكبير أولًا، وتتأخّر المذيلات الحرة الصغيرة. فإن كانت القطعة مُقحَمة تراكبت قمة Cy3 مع قمة Cy5، وإن بقي منها فائض ظهرت قمة منفصلة متأخّرة — هذه هي حيلة التجربة.

والنتيجة: في كل درجات الحرارة تراكبت قمة Cy3 تمامًا مع قمة Cy5. وبقي الحجم في حدود 64〜79 nm، وهو مستوى لا يمكن وصفه بالزيادة مقارنةً بـLNP الخالي (78 nm) (n = 2، والتقرير بالمتوسط والمجال). واعتُمدت 45 ℃ معيارًا فيما بعد.

ودُرس الزمن بالمنطق نفسه: 0 و0.5 و1 و2 ساعة عند 45 ℃. وفي عيّنة 0 ساعة وحدها بقيت قمة Cy3 صغيرة، أمّا في سائر العيّنات فقد تراكبت القمم تمامًا. وهنا تضع الورقة ملاحظة لطيفة من عندها. فعيّنة «0 ساعة» نفسها استهلكت 10 دقائق في الحقن والمرور عبر العمود. أي إنّ من المرجّح أنّ التفاعل اكتمل خلال هذه الـ10 دقائق. ولذلك استنتج المؤلفون أنّ التفاعل «يكتمل في غضون 30 دقيقة».

وفي الليبوزومات، قيل إنّ الزمن الأمثل 2〜4 ساعات، وفي بعض التقارير يبلغ 48 ساعة. أمّا LNP الذي ينتهي في 30 دقيقة فهو أسرع بمقدار 4〜8 أضعاف حتى بالمقارنة مع الزمن الأمثل، وأسرع بفارق هائل بالمقارنة مع أطول التقارير. وهذا فرق كبير جدًّا من الناحية العملية.

④ هناك حدّ أعلى لكمية PEG التي يمكن إقحامها

إلى أيّ حدّ يمكن الحشو إذن؟ غُيّرت نسبة القطعة الموسومة بـCy3 من 0.5% إلى 4%، وأُجري التفاعل عند 45 ℃ لمدة 30 دقيقة.

(المتوسط ± الانحراف المعياري، n = 3)

حتى 2% (أي إجمالي PEG 3.5%) تبقى الأرقام منضبطة تمامًا. لكن عند تجاوز 2% تظهر القطع التي لم تُقحَم على هيئة مذيلات حرة، ويبدأ LNP نفسه بالتهتّك. وبالفعل ارتفع الحجم ارتفاعًا حادًّا إلى 215 ± 269 nm عند 3% وإلى 565 ± 164 nm عند 4%. وتستنتج الورقة أنّ نقطة التشبّع تقع بين 2% و3%، وأنّ 0.1〜0.3% تكفي في الاستخدام العملي.

وهنا أيضًا يظهر الفرق عن الليبوزومات. فالليبوزومات تحتوي عادةً على إجمالي PEG بنسبة 10% أو أكثر، وقيل إنّ نقطة تشبّع post-insertion فيها تقع قرب إجمالي PEG 10%. أمّا LNP فيتشبّع عند إضافة 2〜3% من PEG (أي إجمالي 3.5〜4.5%). ولأنّ المعيارين مختلفان — «الإجمالي» مقابل «المُضاف» — فلا تصحّ مقارنة الأضعاف مقارنةً بسيطة، لكن المحصّلة أنّ PEG الذي يقبله LNP أقل بكثير ممّا تقبله الليبوزومات.

⑤ الوسم لا يُضعف المفعول، وتثبيت العنوان يُسرّع الالتقاط

ونأتي أخيرًا إلى التحقّق الحيوي. استُخدم خطّا الخلايا Kasumi-1 وSKNO-1 — وكلاهما من خطوط خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد البشري (acute myeloid leukaemia, AML)، يحمل t(8;21) ويُعبّر عن RUNX1/ETO.

أولًا: هل يضعف المفعول عند إضافة الصبغة؟ أُوصل siRE بجسيمات LNP موسومة بـCy3 وأخرى غير موسومة، ثم قيست نواتج نسخ RUNX1/ETO بتقنية qPCR بعد 24 ساعة. والنتيجة أنّ كلتا الحالتين أظهرت كبتًا بنحو 2 أضعاف بالمقارنة مع الشاهد غير المتطابق (هذا تعبير الورقة؛ أي انخفاض إلى النصف تقريبًا بالنسبة إلى الشاهد)، ولم يكن هناك فرق دالّ بين الموسومة وغير الموسومة (الدلالة «ns» في الشكل 6A). أي أنّ الوسم الفلوري لا يعيق المفعول.

ثم يأتي الموضوع الأساسي. الربيطة المستخدمة هنا هي LDV، وهي جزيء يرتبط بالإنتغرين VLA-4 (أي α4β1)، وVLA-4 مُعبَّر عنه على نطاق واسع في خلايا الجهاز المكوِّن للدم. وأُقحمت في الجسيم نفسه قطعتان مختلفتان: Cy3 للتتبّع وLDV للتوجيه، ثم تُوبِع الالتقاط بقياس التدفق الخلوي (flow cytometry). وقيس الالتقاط عند الأزمنة 1 و3 و6 و24 ساعة، فتبيّن أنّ جسيمات LNP الحاملة لـLDV التُقطت بكمية أكبر دلاليًّا من تلك الخالية منها (n = 4، تحليل تباين ثنائي الاتجاه؛ والدلالة معروضة كمقارنة بين المجموعتين — بوجود التوجيه أو غيابه — لا عند كل زمن على حدة). وقد انعكس هذا الفرق أيضًا في سرعة انطلاق كبت RUNX1/ETO (الشكل 6C، وهذه التجربة أُجريت عند 0.1 µg/ml).

👦 طالب: وما الفائدة من إمكان تثبيت عنوانَين في الوقت نفسه؟

🧬 إكسوتارو: فائدتان. الأولى إمكان الفصل بين التتبّع والتوجيه؛ إذ يمكن تصميم الصبغة التي تُظهر «إلى أين ذهب الجسيم» والربيطة التي تحدّد «إلى أين نرسله» تصميمًا مستقلًّا لكلٍّ منهما. والثانية تطبيق تلمّح إليه الورقة نفسها، وهو احتمال الوصول إلى أهداف صعبة لا يحدث التقاطها إلا بالارتباط بمستقبلَين في الوقت نفسه. تصوّر بابًا لا يُفتح إلا بمفتاحَين.

كيف سيتغيّر المستقبل؟ (الطريق إلى العيادة)

ماذا أمكن بناؤه بهذه الطريقة؟ نظرة إلى ورقة المتابعة

منهجية التحضير وحدها لا تكفي لقياس المسافة إلى العيادة. ولحسن الحظّ فإنّ لهذه الورقة تكملة. ففي العام التالي، 2023، نشرت المجموعة نفسها في مجلة Leukemia ورقة بعنوان «Nanoparticle-mediated targeting of the fusion gene RUNX1/ETO in t(8;21)-positive acute myeloid leukaemia» (Issa H، Swart LE، وآخرون، Leukemia 2023، المجلد 37، العدد 4، الصفحات 820–834، DOI: 10.1038/s41375-023-01854-8). والمؤلفان Issa وSwart كلاهما من مؤلفي الورقة التي نتناولها.

وبحسب المستخلص، أدّى الكبت العابر لـRUNX1/ETO بجسيمات LNP المحمّلة بـsiRNA إلى تقليل ارتباطه بالجينات المستهدَفة، وإلى تغيّر ارتباط RUNX1 وعامله المساعد CBFβ كذلك. ثم ازداد وسيط مدة البقاء في نموذج الفأر لابيضاض الدم النقوي الحاد الموجب لـt(8;21) ازديادًا كبيرًا، وأُفيد كذلك بأنّ الكبت العابر أدّى إلى تثبيط طويل الأمد لقدرة خلايا الابيضاض على التكاثر وتكوين المستعمرات، وإلى تحريض التمايز النقوي، وإلى هبوط لافت في القدرة على إعادة الزرع. ولخّص المؤلفون ذلك بأنّه «يُظهر قابلية استهداف الجين الاندماجي للتحقّق في المرحلة قبل السريرية». ضربة عابرة واحدة، ومفعول يدوم طويلًا. ومعنى ذلك أنّ ورقة التحضير التي نتناولها اليوم كانت الأساس الذي جعل تلك التجربة ممكنة.

👦 طالب: هل اقترب العلاج إذن؟

🧬 إكسوتارو: لا، نحن ما زلنا في المرحلة قبل السريرية. فبين طول البقاء في الفأر وبين نجاح العلاج في المريض هوّة واسعة. وفي الإنسان تنتظرنا مشكلة تحيّز الجسيمات نحو الكبد، والاستجابة المناعية ضد PEG عند تكرار الجرعات، ومشكلة نقي العظم بوصفه موضعًا يصعب الوصول إليه. ومع ذلك فمن المؤكّد أنّ اتجاه «يمكن استهداف الجين الاندماجي بحسب التسلسل» بدأ يكتسب جسدًا ملموسًا.

المعنى من زاوية مواقع التصنيع

الأمر الكبير من الناحية العملية أنّ post-insertion يتيح تثبيت العنوان في آخر خطوات العملية. فالأجسام المضادة والأجسام النانوية غالية الثمن وهشّة أمام الحرارة والمذيبات العضوية، وإذا خُلطت من البداية فسيكون عليها أن تعبر المزج والديلزة بأكملهما. أمّا هنا فيكفي إنهاء تصنيع الجسيم ثم تفاعل عند 45 ℃ لمدة 30 دقيقة ليثبت العنوان دون أن ترشح الحمولة (مع ملاحظة أنّ ديلزة أخرى طوال الليل تأتي بعد التفاعل، فالعملية كلها لا تنتهي في 30 دقيقة). أي أن نُصنّع الأساس نفسه بكميات كبيرة ثم نغيّر العنوان وحده بحسب الاستخدام — وهذه هي النمذجة الوحدوية (modularity). وإذا أمكن تجنّب إعادة بناء خط الإنتاج لكل هدف، فإنّ بنية تكاليف التطوير تتغيّر.

كيف نقرأ هذا البحث قراءة نقدية؟ (حدوده، وطريق الارتقاء بجودته)

ما يُحسب للورقة

لنكن منصفين أولًا. تصميم المقارنة سليم — فالنقر المباشر وpost-insertion مصطفّان على الأساس نفسه، وبالربيطة نفسها، وبالحمولة نفسها. والتحقّق جارٍ بالأرقام والصور معًا — فالحجم مُقدَّر كميًّا بـDLS، والشكل والبنية الداخلية مرئيان مباشرةً بـcryoEM. ولأنّ قياس DLS تجرّه الجسيمات الكبيرة، فإنّ للتأكيد بالصور معنى حقيقيًّا (وإن لم تُقدَّر توزيعات الحجم كميًّا من cryoEM). وتقييم كفاءة التفاعل واضح — فتصميم وسم الجسيم والقطعة بصبغتين منفصلتين ثم النظر في تراكب القمم تصميم لا تعسّف فيه. وأخيرًا ثمّة تأكيد على أنّ الحمولة لم ترشح. فلا قيمة لكل هذا إن خرج المحتوى أثناء عملية تثبيت العنوان.

ما ينبغي الحذر منه في القراءة

① السند الإحصائي ضعيف. فمقارنات سلسلة 1.5% في الجدول 2 جاءت بقيم p = 0.13 و0.33 و0.099، ولم تبلغ أيٌّ منها مستوى الدلالة (ولا تبيّن الورقة أيّ مقارنة تمثّلها هذه القيم؛ وما ذكرناه استنتاج من خلوّ خانة صفّ «بعد الديلزة»). ومعنى ذلك أنّ أحد الادّعاءات المحورية في الورقة، وهو «أنّ الإقحام قبل الديلزة يضاعف الحجم أو أكثر»، غير مدعوم إحصائيًّا في سلسلة 1.5% التي اعتُمدت شرطًا معياريًّا. أمّا الفروق الدالّة فقد ظهرت في سلسلة 1.2% التي حكم المؤلفون أنفسهم بعدم استخدامها «لأنّها غير مستقرّة».

② حجم العيّنة صغير، والاستنتاجات السلبية ضعيفة بسببه. فالجداول 1 و2 و4 عند n = 3، أمّا الجدولان 3 و5 فعند n = 2 مع تقرير النتائج بـ«المتوسط والمجال» لا بالانحراف المعياري. والجزم باستنتاج سلبي من نوع «لا يتوقّف على الحرارة» أو «لا يتوقّف على الزمن» بناءً على قياسين فقط يحتاج إلى تحفّظ؛ فلا يمكن التمييز بين عدم وجود فرق وبين عدم القدرة على كشف الفرق. يُضاف إلى ذلك أنّ شرط 3% في الجدول 4 جاء 215 ± 269 nm، أي إنّ الانحراف المعياري يتجاوز المتوسط، وهو ما يصلح قرينة على التهتّك لكنّه لا يُقرأ على أنّه «الحجم يصبح كذا عند 3%».

③ أرقام متطابقة تتكرّر في الجدولين 3 و5. فـLNP 1.0 في الجدول 3 وLNP 2.0 في الجدول 5 كلاهما 78 [65, 90] nm وPDI 0.205 [0.144, 0.266]، وكذلك شرط 45 ℃ لمدة 2 ساعة في الجدول 3 وشرط 2 ساعة في الجدول 5، فكلاهما 64 [60, 68] nm وPDI 0.197 [0.174, 0.219]. والأقرب إلى الطبع أنّ الأمر إعادة عرض للتجربة نفسها، لكن لا تنبيه على ذلك، وهو ما يترك مجالًا لأن يُفهم خطأً أنّهما تجربتان مستقلّتان.

④ ثمّة تعارضات بين النصّ والجداول والأشكال. ولأنّ ذلك قد يُلحق ضررًا فعليًّا بالقارئ الذي يحاول إعادة التجربة، نذكرها بالتفصيل.

• زمن التفاعل في الشكل 5 مختلف بين الشكل نفسه وشرحه. ففي سهم الشكل 5B مكتوب «30 min at 45 °C»، بينما شرح الشكل ذاته يقول إنّ «التفاعل يُجرى عند 45 ℃ لمدة 2 ساعة». وخلاصة النصّ هي «45 ℃ لمدة 30 دقيقة». أي أنّ الزمن غير متّسق في شكل يُفترض أن يعرض الإجراء المُحسَّن.
• هناك مواضع عدّة لا تتوافق فيها الإحالات والأرقام مع الجداول. فشرح الجدول 1 يقول إنّ «الرموز تقابل أشكال المجهر الإلكتروني البردي (الشكل 1)»، مع أنّ صور cryoEM في الشكل 2. وقول النصّ «زاد القُطر بنسبة 50% (الجدول 1، الصفّ 2 والصفّ 4)» لا يصحّ، فالصفّ 2 عند 110 nm والصفّ 4 عند 93 nm، أي إنّ القُطر نقص فعليًّا (الزيادة بنحو 50% تظهر في المقارنة مع الصفّ 1 عند 63 nm). وكذلك عبارة «زاد حجم LNP ذي 1.5% PEG بنسبة 10〜30%»، فالمقارنة المقابلة في الجدول 2 هي 66 nm → 93 nm، أي زيادة بنحو 41%. ويكتب النصّ عن شرط 3% أنّ «المتوسط 218 nm» بينما الجدول 4 يسجّل 215 ± 269 nm.

ولا شيء من ذلك يقلب النتائج، فهي أخطاء من النوع الذي يُصلحه التدقيق اللغوي. لكن قيمة ورقة البروتوكول تكمن في «إمكان التصنيع تمامًا كما هو مكتوب»، ولذلك فالمسألة ليست هيّنة بالنسبة لمن يحاول إعادة التجربة.

⑤ لا نخطئ فهم معنى «التوجيه». فـVLA-4 الذي يرتبط به LDV «مُعبَّر عنه على نطاق واسع في خلايا الجهاز المكوِّن للدم»، كما تكتب الورقة نفسها. أي إنّه ليس هدفًا خاصًّا بخلايا الابيضاض. وما أظهرته هذه التجربة ليس «القدرة على انتقاء خلايا الابيضاض وحدها واستهدافها»، بل إثبات مبدأ يقول: «تثبيت العنوان يُسرّع الالتقاط ويُسرّع انطلاق المفعول». والورقة نفسها لا تدّعي أكثر من ذلك، لكنّه موضع يسهل على القارئ أن يخلط فيه.

⑥ كل شيء هنا داخل الأنبوب والخلية. فلا توجد تجارب على الحيوان. وخطوط الخلايا نوعان فقط، ولم تُستخدم خلايا مأخوذة من مرضى. أمّا الاستقرار في المصل، وزمن البقاء في الدم، والاستجابة المناعية — وهي عوامل تحكم المسار السريري أكثر من الحجم — فهي خارج نطاق هذه الورقة. كذلك فإنّ طريقة قياس كفاءة التغليف مذكورة في فصل الطرائق، لكن النسبة الفعلية التي تحقّقت غير معروضة في جداول النصّ. ومدة الحفظ قبل القياس موصوفة بأنّها «تصل إلى 7 أيام»، وهو مجال واسع يمكن أن يكون أحد أسباب التشتّت في النتائج.

⑦ خلفية غير مذكورة في الورقة (من معلومات متاحة للعموم). فالمؤلف المشارك Schiffelers يعمل، بحسب ملفه التعريفي المنشور على موقع مؤسّسته، محرّرًا في International Journal of Pharmaceutics، وهي المجلة التي نُشرت فيها هذه الورقة. ولا ذِكر لذلك في خانة تضارب المصالح. وللمجلات العلمية إجراءات معيارية للتعامل مع الأبحاث المقدَّمة من أشخاص مرتبطين بهيئة التحرير، وهذا في ذاته لا يعني وجود مخالفة، لكنّني أذكره لأنّني أرى أنّ من حقّ القارئ معرفته كخلفية. أمّا طلب براءة الاختراع للمؤلف المسؤول فقد أُفصح عنه كما ينبغي.

كيف كان يمكن أن يرتفع البحث إلى جودة أعلى؟

• زيادة n وتحديد تصميم الاختبارات الإحصائية مسبقًا. فالاستنتاجات السلبية من نوع «لا يتوقّف على الحرارة» و«لا يتوقّف على الزمن» تحتاج تحديدًا إلى تصميم يُظهر التكافؤ وإلى بيان القوة الإحصائية
• مطابقة أرقام الأشكال والجداول والنصّ مطابقة آلية. فالتعارضات المذكورة أعلاه يمكن إزالتها بقائمة تحقّق قبل تقديم الورقة
• عرض كفاءة التغليف وجهد زيتا والاستقرار في المصل بأرقام. فالحجم وPDI وحدهما لا يكفيان لتوصيف خصائص المستحضر
• المقارنة مع ربيطات أكثر نوعية. فـVLA-4 صالح لإثبات المبدأ لكنّه لا يصلح لتقييم الانتقائية. ووضعه جنبًا إلى جنب مع أهداف محدودة الانتشار مثل CD33 أو CLEC12A يوضّح معنى «التوجيه»
• وضع خلايا المرضى جنبًا إلى جنب مع الخلايا السلفية الدموية الطبيعية. فمقدار الزيادة في الالتقاط داخل الخلايا الطبيعية رقم نريد معرفته من زاوية السلامة
• قياس كفاءة التغليف والرشح في شرط النقر المباشر أيضًا. فذلك يوفّر سندًا كميًّا لمقولة «إنّ الجسيم يتهتّك»

وجهة نظر إكسوتارو

أصدقكم القول. هذه الورقة ليست تخصّصي بعينه. فما أعمل عليه هو علاج الأمراض العصبية، وفي مقدّمتها إصابة الحبل الشوكي (spinal cord injury, SCI)، باستخدام الخلايا الجذعية الوسيطة (mesenchymal stem cell, MSC) والحويصلات خارج الخلوية (extracellular vesicle, EV) الصادرة عنها. أمّا ابيضاض الدم عند الأطفال وتصميم مستحضرات LNP فليسا من المجالات التي حرّكت يدي فيها. ولذلك فأنا أقرأ تفاصيل كيمياء المستحضرات واقفًا في الصفّ نفسه الذي يقف فيه القرّاء.

ومع ذلك اخترت هذه الورقة لأنّ ما كُتب فيها ينعكس على مجالنا انعكاسًا مباشرًا.

أولًا: post-insertion أسلوب يُستخدم كما هو في تعديل سطح الإكسوسومات. فالباحث الذي يريد توجيه EV يصنع قطعة دهن–PEG مربوطة ببِبتيد أو بربيطة، ثم يُقحمها في EV بعد اكتماله. والفكرة والقطع المستخدمة كلّها تكاد تكون نفسها الواردة في هذه الورقة. ولذلك فالتنبيهات التي أبدتها الورقة — خصائص الجسيم تتغيّر بحسب توقيت الإقحام، وللكمية التي يمكن إقحامها حدٌّ أعلى، والبنية قد تتهتّك أثناء التفاعل — تتحوّل إلى أسئلة ينبغي أن نحملها معنا نحن من نعمل على EV. وبصراحة، إن سُئلت هل أعدتُ قياس توزيع الأحجام بعناية بعد إقحام القطع في EV، فلن أستطيع أن أنفخ صدري بالجواب.

ثانيًا، وهذه أثقل نقطة في المقال: الدرس الحقيقي من هذه الورقة هو أنّ «الإجراءات لا تُنقل من نوع جسيم إلى نوع آخر». يكتب المؤلفون في الخاتمة أنّ حركية post-insertion وثرموديناميكيّته قد تختلفان بين الليبوزومات وLNP، وأنّه لا يمكن نقل إجراء رسخ في أحد الجسيمَين إلى الآخر نقلًا متسرّعًا. وبالفعل، فالتفاعل الذي قيل إنّه يستغرق في الليبوزومات من بضع ساعات حتى 48 ساعة ينتهي في LNP في 30 دقيقة؛ وفي مقابل ليبوزومات تحتوي عادةً إجمالي PEG بنسبة 10% أو أكثر، فإنّ PEG الذي يمكن إضافته إلى LNP لا يتجاوز 2%. وحتى الفرق بين ما قبل الديلزة وما بعدها لم يُفَد به في الليبوزومات.

فماذا عن EV إذن؟ إنّ EV يملك، من حيث البنية، غشاءً دهنيًّا مزدوجًا قريبًا من الليبوزوم. لكن غشاءه مرصوص ببروتينات غشائية، في مقدّمتها التيتراسبانينات (tetraspanins)، وسطحه مغطّى بطبقة من البروتين، والأهم من ذلك كلّه أنّه من صناعة الكائن الحي، فكل حبيبة منه تختلف عن الأخرى. فهو ليس ليبوزومًا ولا LNP، بل جسيم ثالث. وإذا مدّدنا منطق هذه الورقة تمديدًا مستقيمًا، فالخلاصة أنّ سؤال «ماذا سيحدث في حالة EV؟» لا جواب له إلا بالقياس على EV نفسه.

وما يمنح هذا الطرح ثِقَلَه أنّ Schiffelers، صاحب التصوّر العام للورقة، نال الدكتوراه في الليبوزومات، وحصل على منحة ERC في الحويصلات خارج الخلوية، وصار عضوًا مؤسِّسًا في ISEV — أي إنّه شخص تنقّل فعليًّا بين الجسيمات الثلاثة. وورود اسم الباحث في الحويصلات خارج الخلوية Pieter Vader في فقرة الشكر يخبرنا أيضًا عن نوع التربة التي نبتت فيها هذه الورقة.

ثالثًا، وإذا قرّبنا الأمر إلى موضوعي الأصلي، تتّضح أيضًا المسافة التي لم نقطعها بعد. فما تناولته هذه الورقة خلايا ابيضاض تسبح في وسط الاستنبات. والخلايا الموجودة في الدم يمكن القول إنّها أسهل ما يمكن للجسيم أن يصل إليه. أمّا ما نريد نحن الوصول إليه فهو نسيج عصبي مصاب يقع خلف الحائل الدموي–الدماغي والحائل الدموي–الشوكي. فأن تكتمل تقنية تثبيت العنوان شيء، وأن نتمكّن من بلوغ العنوان المكتوب شيء آخر.

ومع ذلك أرى أنّ الترتيب صحيح. فالمضيّ في مناقشة جهة الوصول وحدها، دون إحكام تقنية الإيصال، لا يُنتج شيئًا ذا شكل. إنّه عمل غير برّاق، لكن لا بدّ أن يقوم به أحد. وجودة هذا النوع من العمل تظهر بعد سنوات على هيئة منحنى بقاء في ورقة أخرى. وبالفعل، في السنة التالية لورقة التحضير هذه خرجت بيانات البقاء من المجموعة نفسها.

وأخيرًا ملاحظة عن أسلوب الكتابة. عندما تعارضت نتائج المؤلفين مع المعرفة السابقة عن الليبوزومات، لم تكتب الورقة أنّ «تقارير الليبوزومات خاطئة». بل كتبت: «لأنّ نوع الجسيم مختلف، فالإجراء غير قابل للنقل». أي إنّها تُرتّب المسألة كمسألة نطاق انطباق، لا كمسألة أيّهما الصحيح. موقف متواضع بلا بهرجة، لكنّني أثق بهذا النوع من الكتابة.

ملاحظة: كُتب هذا المقال بمساعدة الذكاء الاصطناعي.