脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle, LNP）因新冠的mRNA疫苗而彻底出名。它是把脆弱的RNA包进脂质微粒、一路送进细胞内部的运输工具。疫苗只要打进肌肉，在注射部位和附近的淋巴结里起效就够了，所以“送到哪里去”并不是什么大问题。
可是，一旦想只瞄准特定的细胞，情况就不一样了。送进血流的颗粒，放任不管就会聚集到肝脏。如果想把收件人指定成“只给白血病细胞”“只给神经细胞”，就必须在颗粒表面贴上“收件地址”——也就是能与靶标结合的配体或抗体。
这次要介绍的，是一篇只正面钻研如何贴上这个地址的论文。听起来也许不够光鲜，但如果贴地址的操作把包裹本身压坏了，那就毫无意义。这篇论文测量的，恰恰就是这一点。
先说明两点。第一，这是2022年的论文。现在仍要介绍它，是因为它是支撑同一团队2023年动物实验（后述）的基础，而且这里用到的手法与外泌体的表面改造完全一脉相承。第二，这是在细胞和试管中完成的研究。它谈的不是已经可以用在患者身上的治疗。
期刊信息
- 论文标题：A robust post-insertion method for the preparation of targeted siRNA LNPs（用于制备靶向siRNA LNP的稳健post-insertion法）
- 论文类型：原创研究论文（制剂学与药物递送的方法学研究）
- 发表期刊：International Journal of Pharmaceutics 第620卷，论文编号121741（2022年2月1日投稿，4月8日接受，4月11日在线发表）
- DOI / 链接：10.1016/j.ijpharm.2022.121741
- 许可：开放获取（CC BY 4.0）。任何人都可以读到全文
- 影响因子：大致在5左右（逐年有波动。在制剂学与药物递送领域，它是一份历史悠久的专业期刊）
- 作者：L.E. Swart（第一作者）、C.A. Koekman、C.W. Seinen、H. Issa、M. Rasouli、R.M. Schiffelers、O. Heidenreich（通讯作者）共7人
- 单位：玛西玛公主儿童肿瘤中心（荷兰乌得勒支）、乌得勒支大学医学中心（UMC Utrecht）临床化学与血液学系、纽卡斯尔大学沃尔夫森儿童癌症研究中心（英国）、法兰克福大学医院儿科（德国）
- 资助：荷兰的儿童癌症研究支持机构 KiKa 的项目资助（grant 329）
- 利益冲突披露：通讯作者 Heidenreich 就“Targeted lipid nanoparticle formulations（靶向脂质纳米颗粒制剂）”已提交专利申请（按论文的措辞，是以归属于玛西玛公主儿童肿瘤中心的形式提交的）
通讯作者是怎样的研究者
通讯作者 Olaf Heidenreich 是玛西玛公主儿童肿瘤中心的研究组长，同时也是英国纽卡斯尔大学的分子血液学教授、儿童癌症研究方向负责人。他的研究主线始终如一：白血病中因染色体互换而形成的“融合基因”该怎么打掉。其中，由 t(8;21) 易位产生的 RUNX1/ETO（也写作 RUNX1/RUNX1T1、AML1/ETO），他已经追了20多年。2003年他在 Blood 上发表论文，报告用siRNA抑制AML1/MTG8（＝RUNX1/ETO）之后，t(8;21) 阳性白血病细胞会走向髓系分化。
融合基因只存在于癌细胞里，是理想的靶点，却也是传统小分子药难以瞄准的对手（一般认为，由两个转录因子融合而成的蛋白质，没有能让药物插进去的深口袋）。于是有力的候选就成了“按序列瞄准”的siRNA。而要把这段siRNA送到位，就需要运输工具——这篇论文做的，正是把这个运输工具整备好。
共同作者 Raymond M. Schiffelers（在本论文中负责构思与监督）是UMC Utrecht的纳米医学教授。这里是本次的关键，所以稍微详细地介绍一下。他的博士研究（鹿特丹伊拉斯姆斯大学，1996–2001年）题目是“抗菌药的脂质体靶向化”——也就是说，他是在脂质体里长大的研究者。2010年，他凭“受微囊泡启发的药物递送系统”获得ERC资助，并且是国际细胞外囊泡学会（International Society for Extracellular Vesicles, ISEV）的创始成员，还担任 Journal of Extracellular Vesicles 的副主编。一位站在细胞外囊泡世界中心的人物，从构思阶段就参与了合成纳米颗粒LNP的制剂论文。不过要说清楚，论文本身一次也没有提到细胞外囊泡。它比较的对象是脂质体和LNP。但作者阵容横跨这三种颗粒这一点，会接到后半段要讲的内容。
第一作者 Laura E. Swart 负责方法建立、实验、分析与论文撰写，后面要提到的2023年续篇里也有她的名字。
在此之前，到底有什么还不清楚？
脂质体和LNP，外表相似但内部不同
包裹药物的纳米颗粒里的老资格是脂质体。它是用与细胞膜相同的脂质双层膜（lipid bilayer）做成的袋子，里面装的是水。从1990年代起就用在临床上。
另一方面，运送 siRNA 的 LNP 结构不同。按论文的说法，LNP的内部几乎是一个疏水的核心，里面塞满了反向排列的脂质胶束，而这些胶束把核酸包在其中。它不是装水的袋子，而是内部填实的颗粒。实际上在这篇论文的电子显微镜照片里，LNP也呈现为内部发黑、填得满满的球体。
👦 学生：两种都是“脂质的颗粒”，那按同样的方式处理不就行了吗。
🧬 艾克索太郎：这正是陷阱所在。请把脂质体想成气球，把LNP想成塞满豆沙的团子。往气球的膜上插饰物，和往团子的表面上插，插的方式不同，插进去之后崩坏的方式也完全不同。
给脂质体贴地址的操作已经很成熟。只要事先给配体接上一条脂质尾巴，这条尾巴就会自发地钻进双层膜里。可是LNP里，根本没有可以钻进去的双层膜。这就是这篇论文的出发点。
还有一个必须守住的条件：颗粒的流体动力学直径。论文引用先行研究，把 40〜150 nm 称为“金发姑娘区间”（Goldilocks zone）。比这更小就会被肾脏滤掉，太大则进不了组织。尺寸不是次要指标，而是决定它能不能用的条件。
两种做法哪一种更好
论文比较的是下面两种（论文的图1）。
- 表面直接修饰——先做出颗粒，再把配体直接接到露在表面的反应基团上（图1A）
- post-insertion（事后插入）——先把配体和脂质连好、做成一个零件，再把这个零件插进已经做好的颗粒里（图1B）
连接的方式选的是点击反应，而且是不用铜的那一类。它的正式名称是应变促进的叠氮–炔环加成（strain-promoted azide-alkyne cycloaddition, SPAAC）。
👦 学生：为什么要避开铜呢。
🧬 艾克索太郎：铜（I）作为催化剂很出色，但对生物有毒。于是人们改用故意被扭曲的环状炔（DBCO）。扭曲让它的能量变高，即使没有催化剂也会自己和叠氮反应。把卡扣按下去就“咔”地一声扣住——点击反应这个名字就是从这里来的。
最后一个变量是时机。做好LNP之后，有一道用透析把乙醇抽走的工序。透析不只是除去溶剂，它还会中和表面电荷、让脂质的排列稳定下来，把颗粒“熟化”。贴地址这件事，是在透析之前做，还是之后做。此前谁都没有系统地查过。
这篇论文弄清了什么？
怎么做——材料与步骤
作为底座的LNP，是把 DLin-MC3-DMA（可电离脂质）、DSPC、胆固醇、DMG-PEG(2000)、DSPE-PEG(2000)-DBCO 按摩尔比 50:10:38.5:1.2:0.3 溶进乙醇里做成的。要做post-insertion时，为了留出插入的余地，改成了 50:10:38.5:1.5:0.1。
siRNA 用 25 mM 乙酸（pH 4）稀释，调到 N/P 比 4，再用 NanoAssemblr Benchtop 这台微流控装置，以总流速 4 ml/min、脂质:siRNA 的流速比 1:3 混合。之后用 10 kDa 截留膜，在 4 ℃ 下过夜对PBS透析，抽走乙醇并完成中和。
装载的 siRNA 有两种。siRE 是瞄准 RUNX1/ETO 融合点的主角，siMM 则是把两个碱基换掉的错配对照。用只改动了几个碱基的对照，是为了证明“起作用的是序列”而不是“颗粒进去了”，属于基本设计。制作地址零件时，按 DBCO:叠氮 = 3:1 的摩尔比，在室温下过夜。做好的零件实际上会在4 ℃下最多放置7天之后再使用（这并不等于其保存期限得到了验证）。
① 在表面直接连接，颗粒就崩了
这是这篇论文里最容易看懂的结果。作者把4个条件，用动态光散射（DLS）测得的尺寸和冷冻电镜（cryoEM）下的形貌两方面来比较。
| 条件 | 流体动力学直径 | PDI（离散度） |
|---|---|---|
| A 空白LNP（DMG-PEG 1.5%） | 63 ± 9 nm | 0.09 ± 0.05 |
| B 混合时只加入0.1%带DBCO的脂质 | 110 ± 4 nm | 0.18 ± 0.01 |
| C 把配体直接点击到表面的DBCO上 | 153 ± 9 nm | 0.25 ± 0.004 |
| D 透析后把配体零件做post-insertion | 93 ± 23 nm | 0.16 ± 0.04 |
（平均值 ± 标准差，n = 3。PDI＝多分散指数。越接近0，颗粒就越整齐）
cryoEM 的图像解释了这些数字的含义。A 中填实的球体排列整齐，B 的核心结构也得以保持。可是在 C——也就是在表面直接连接的那一组——球形崩坏了，出现了胶束状的碎片，照片里甚至还能看到多个LNP疑似融合而成的、大的多层膜颗粒（论文图2C中的白圈）。另一方面，D 保持着球形和填实的核心。
👦 学生：到B这一步就已经110 nm了。只是加了DBCO而已，为什么会膨胀呢。
🧬 艾克索太郎：论文的推测是这样的。当DBCO没有和叠氮结合时，这个基团会朝向颗粒内侧。先行研究报告过PEG在自组装过程中钻进颗粒内部的现象，作者认为这和那是一回事。也就是说，你要从外面去和一个已经转向内侧的基团反应。所以“先组装好再插入”更顺理成章——不过再往下的机理，论文并没有去测。
这个趋势既不依赖配体的种类，也不依赖载荷的种类。在把配体换成VHH（纳米抗体）、把载荷换成DNA条形码的补充数据里也一样，post-insertion把尺寸增加压在了50%以内。
② “透析之前还是之后”，改变了尺寸
接下来改变时机。作者用Cy3这种荧光染料标记的LNP，准备了PEG含量不同的两个系列（DMG-PEG 1.5% 与 1.2%）。
| 样品 | DMG-PEG | 插入物 | 时机 | 尺寸 | PDI | p值 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| LNP 1.0 | 1.5% | 无 | — | 66 ± 8 nm | 0.147 ± 0.076 | 0.13 |
| LNP 1.1 | 1.5% | DBCO 0.1%（未结合） | 透析前 | 117 ± 30 nm | 0.147 ± 0.051 | 0.33 |
| LNP 1.2 | 1.5% | 结合物 0.1% | 透析前 | 124 ± 10 nm | 0.140 ± 0.052 | 0.099 |
| LNP 1.3 | 1.5% | 结合物 0.1% | 透析后 | 93 ± 23 nm | 0.161 ± 0.038 | — |
| LNP 2.0 | 1.2% | 无 | — | 73 ± 10 nm | 0.136 ± 0.044 | 0.22 |
| LNP 2.1 | 1.2% | DBCO 0.3%（未结合） | 透析前 | 137 ± 19 nm | 0.181 ± 0.102 | 0.008 |
| LNP 2.2 | 1.2% | 结合物 0.3% | 透析前 | 172 ± 4 nm | 0.201 ± 0.045 | < 0.0001 |
| LNP 2.3 | 1.2% | 结合物 0.3% | 透析后 | 82 ± 4 nm | 0.246 ± 0.053 | — |
（平均值 ± 标准差，n = 3。p值为双侧Student t检验。论文没有写明这些p值比较的是哪两组，但由于“透析后”那一行是空白，可以读作以它为基准的比较）
趋势很清楚。透析前加入就会远远超过100 nm，透析后插入则收得最小。论文把这一点总结为“除去溶剂的时间点是决定性的”。
PEG含量带来的差别也出现了。在1.2%系列里，即便透析后插入，PDI也从 0.136 升到了 0.246；而在1.5%系列里则是从 0.147 到 0.161，几乎没动。论文讨论认为，PEG少的LNP本来就不稳定、容易聚集，大概在post-insertion的过程中就抱团了。此后作者们把 1.5% 定为标准。不过p值这一列需要留意。1.5%系列的那些比较，没有一个达到显著水平。这一点会在后半段展开。
👦 学生：PDI这个数字，看的是什么呢。
🧬 艾克索太郎：是颗粒的整齐程度。越接近0，说明颗粒大小越一致；数值越大就越参差不齐。在制剂里，它和平均尺寸一样受重视。因为大小混杂的群体在体内的行为难以预测，作为质量指标也不稳定。
③ 温度在25〜55 ℃之间哪里都行，30分钟就结束
在脂质体上，有报告说post-insertion的效率强烈依赖温度，并受脂质的相变温度左右。那LNP呢。
作者把带Cy3的零件，与装载了Cy5标记siRNA的LNP，在 25、35、45、55 ℃ 下各反应2小时。把siRNA的染料和插入零件的染料分开来用，是其中巧妙的地方。效率的判定用的是 FPLC 上的共洗脱。在 Sepharose CL-4B 的柱子上，大的LNP出得早，小的游离胶束出得晚。零件插进去了，Cy3的峰就会和Cy5的峰重合；没插进去而剩下来，就会延迟出现另一个峰——机关就在这里。
结果，在任何温度下，Cy3的峰都与Cy5的峰完全重合。尺寸也落在 64〜79 nm，与空白LNP（78 nm）相比谈不上增加（n = 2，以平均值和范围报告）。此后的标准定为 45 ℃。
时间也用同样的思路考察。在 45 ℃ 下取 0、0.5、1、2小时。只有0小时的样品还留着一个小的Cy3峰，其余都完全重合。这里有论文自己写下的、让人舒服的一条注释。即便是“0小时”的样品，注入和过柱也要花10分钟。也就是说，反应很可能在那10分钟里就已经结束。所以作者们的结论是“30分钟以内完成”。
在脂质体上，最佳反应时间据称是2〜4小时，有的报告甚至长达48小时。30分钟就结束的LNP，与最佳时间相比快4〜8倍，与那些长时间的报告相比则快了一个数量级以上。在实际操作上，这是相当大的差别。
④ 能加进去的PEG有上限
那么，到底能塞进去多少。作者把带Cy3的零件从 0.5% 变到 4%，在 45 ℃ 下反应30分钟。
| 追加的PEG | 颗粒中的总PEG | 尺寸 | PDI |
|---|---|---|---|
| 0.5% | 2.0% | 58 ± 1 nm | 0.151 ± 0.059 |
| 1.0% | 2.5% | 61 ± 2 nm | 0.165 ± 0.030 |
| 1.5% | 3.0% | 61 ± 4 nm | 0.132 ± 0.006 |
| 2.0% | 3.5% | 64 ± 6 nm | 0.158 ± 0.070 |
| 3.0% | 4.5% | 215 ± 269 nm | 0.249 ± 0.106 |
| 4.0% | 5.5% | 565 ± 164 nm | 0.310 ± 0.128 |
（平均值 ± 标准差，n = 3）
到2%（总PEG 3.5%）为止，一切都收得很漂亮。可是超过2%以后，没能插进去的零件就会以游离胶束的形式出现，LNP本身也开始坏掉。实际上，3%时跳到 215 ± 269 nm，4%时跳到 565 ± 164 nm。论文的结论是上限落在2%与3%之间，而实用上 0.1〜0.3% 就够了。
这里又一次显出与脂质体的差距。脂质体理所当然地含有总PEG 10%以上，post-insertion的上限据称也在总PEG 10%附近。而LNP则是能追加的PEG在2〜3%这个水平（换算成总PEG是3.5〜4.5%）就到顶了。由于“总量”和“追加量”的基准不同，不能简单地做倍数比较，但结论是LNP能接受的PEG比脂质体少得多。
⑤ 加了标记药效不降，贴上地址摄取变快
最后是生物学上的验证。用到的是 Kasumi-1 和 SKNO-1——两者都带有 t(8;21) 并表达 RUNX1/ETO，是人急性髓系白血病（AML）的细胞系。
先看“加了染料之后药效会不会下降”。作者用带Cy3标记和不带标记的LNP递送 siRE，24小时后用qPCR测 RUNX1/ETO 的转录产物。结果，两者相比错配对照都实现了约2倍的敲低（论文的表述。相对于对照大约减半），带标记与不带标记之间没有显著差异（图6A中的“ns”）。荧光标记并没有妨碍药效。
接下来是正题。这里用到的配体是 LDV。它是一种与 VLA-4（整合素α4β1）结合的分子，而 VLA-4 在造血系统的细胞上广泛表达。作者把Cy3（用于追踪）和 LDV（用于靶向）这两种零件插进同一个颗粒，再用流式细胞术追踪摄取。在1、3、6、24小时各个时间点测定摄取，结果带LDV的LNP比不带LDV的LNP被摄取得显著更多（n = 4，双因素方差分析。显著性不是按时间点给出的，而是作为有无靶向这一组间比较给出的）。这个差别也体现在 RUNX1/ETO 敲低的起效速度上（图6C。这一组实验用的是 0.1 µg/ml）。
👦 学生：能贴两个地址，好处是什么呢。
🧬 艾克索太郎：有两点。一是可以把追踪和靶向分开。看“去了哪里”的染料，和决定“让它去哪里”的配体，可以独立设计。二是论文自己暗示的应用，有可能送达那些必须同时结合两个受体才会被摄取的困难靶标。就像一道必须用两把钥匙才能打开的门。
未来会怎样改变？（通往临床的路）
用这个方法做出了什么——看后续报道
单凭制剂的方法学，是量不出到临床还有多远的。幸好，这篇论文有后续。第二年也就是2023年，同一团队在 Leukemia 上发表了 Nanoparticle-mediated targeting of the fusion gene RUNX1/ETO in t(8;21)-positive acute myeloid leukaemia（Issa H、Swart LE 等，Leukemia 2023年第37卷第4期820–834页，DOI: 10.1038/s41375-023-01854-8）一文。第一作者 Issa 和 Swart，都是本次这篇论文的作者。
据摘要，用装载siRNA的LNP瞬时敲低 RUNX1/ETO 之后，它与靶基因的结合减少，RUNX1 及其辅因子 CBFβ 的结合也发生了变化。而且报告称，t(8;21) AML小鼠模型的中位生存期大幅延长，并且这种瞬时的敲低带来了白血病细胞增殖能力与克隆形成能力的长期抑制、向髓系的分化诱导，以及再移植能力的显著下降。作者们把这总结为“展示了以融合基因为靶点在临床前阶段的可行性”。只是瞬时打了一下，却能长久有效。这次这篇制剂论文，就是让那个实验得以成立的地基。
👦 学生：那么，治疗已经很近了吗。
🧬 艾克索太郎：不，还处在临床前阶段。小鼠里生存期延长，和在患者身上有效，这两件事之间隔得很远。在人身上，还有颗粒偏向肝脏的问题、反复给药时对PEG的免疫反应、以及骨髓这个难以到达的部位的问题在等着。不过，“融合基因可以按序列去瞄准”这个方向确实开始有了实体。
从生产现场看的意义
在实务上意义重大的一点是，用post-insertion就可以把地址留到工序的最后再贴。抗体和纳米抗体都很贵，既怕热也怕有机溶剂，如果从一开始就混进去，就得让它们整个经历混合与透析。把颗粒做完之后，45 ℃、30分钟的反应就能贴上地址，载荷也不会漏（不过反应之后还要再过一夜透析，所以整个工序并不是30分钟就结束）。大量制造同一个底座，按用途只换地址——这就是模块化。如果不必为每个靶标重建生产线，开发成本的结构就会改变。
怎样批判性地读这项研究（局限，以及进一步提高质量的路）
值得肯定的地方
先说公道话。比较的设计是正确的——直接点击与post-insertion被放在同一个底座、同一种配体、同一种载荷上并列比较。数字和图像两方面都做了确认——尺寸用DLS定量，形状与内部结构用cryoEM直接看。DLS这种测量容易被大颗粒带偏，所以用图像来佐证是有意义的（不过作者并没有从cryoEM定量尺寸分布）。反应效率的判定很清晰——给颗粒和零件分别标上不同的染料，看峰是否重合，这个设计没有勉强之处。而且作者确认了载荷没有泄漏。如果贴地址的操作把里面的东西放了出来，那就白费功夫了。
需要留神去读的地方
① 统计上的支撑很弱。表2中1.5%系列的比较是 p = 0.13、0.33、0.099，没有一个达到显著水平（另外，论文并没有写明这些p值比较的是哪两组。这是从“透析后”那一行留空推测出来的）。也就是说，“透析前会膨胀到两倍以上”这个本论文的中心主张之一，在被采纳为标准条件的1.5%系列里并没有得到统计上的支持。出现显著差异的，反而是作者自己判断“不稳定所以不用”的1.2%系列。
② n 太小，支撑不起否定性的结论。表1、表2、表4是 n = 3，表3和表5是 n = 2，而且报告的不是标准差，而是“平均值与范围”。用两次测量去主张“不依赖温度”“不依赖时间”这样的否定性结论，需要相当谨慎。到底是没有差别，还是没有能力发现差别，这两者无法区分。此外表4的3%条件是 215 ± 269 nm，标准差超过了平均值，这可以作为颗粒已经坏掉的旁证，但不能读成“3%时就会变成这个大小”。
③ 表3和表5里排着相同的数字。表3的 LNP 1.0 与表5的 LNP 2.0 都是 78［65, 90］nm、PDI 0.205［0.144, 0.266］；表3的45 ℃、2小时与表5的2小时都是 64［60, 68］nm、PDI 0.197［0.174, 0.219］。把它看作同一个实验的重复刊载是自然的，但论文没有加说明，留下了被误解成独立实验的空间。
④ 正文、表格和图之间存在不一致。这对想要重现实验的读者可能造成实际损害，所以这里具体列出来。
- 图5的反应时间，在图里和图注里不一样。图5B的箭头上画着“30 min at 45 °C”，而同一张图的说明文字却写着“反应在45 ℃下进行2小时”。正文的结论是“45 ℃、30分钟”。这是一张用来展示优化后流程的图，而时间却不一致。
- 有多处引用位置和数值与表格不符。表1的说明文字写“符号对应于冷冻电镜图（图1）”，但冷冻电镜是图2。正文说“直径增加了50%（表1，第2个与第4个）”，可第2个是110 nm、第4个是93 nm，实际上是减少（增加约50%的是与第1个63 nm的比较）。“使1.5% PEG的LNP增大了10〜30%”也一样，表2中对应的比较是 66 nm → 93 nm，约增加41%。3%条件正文写成“平均218 nm”，而表4是 215 ± 269 nm。
这些都不足以推翻结论，属于校对就能改掉的那类错误。不过方法学论文的价值，就在于“照着做就能做出来”这一点，所以对重现的一方来说，这不是小问题。
⑤ 不要误解“靶向”的含义。LDV所结合的 VLA-4，正如论文自己写的那样，“在造血系统的细胞上广泛表达”。它不是白血病细胞特异的靶点。这个实验所展示的，不是“能够只挑出白血病细胞来瞄准”，而是“贴上地址之后摄取变快，效果的起步也变快”这一原理的验证。论文本身也没有主张得更多，但这是读者容易混淆的地方。
⑥ 全部都是试管和细胞里的事。没有动物实验。细胞系只有两种，也没有用患者来源的细胞。血清中的稳定性、血中滞留时间、免疫反应——这些比尺寸更能左右临床的因素，都在这篇论文的范围之外。另外，包封效率的测定方法虽然写在方法一章里，但实际是多少%，正文的表里并没有给出。到测定之前的保存时间也有“最长7天”这样的跨度，可能成为波动的一个原因。
⑦ 论文里没有写出的背景（公开信息）。共同作者 Schiffelers，按其所属机构的公开简介，担任本论文发表期刊 International Journal of Pharmaceutics 的编辑。利益冲突一栏里没有记载这一点。学术期刊对涉及编辑相关人员的投稿有标准的处理程序，这本身并不意味着不当行为，但我认为这是读者作为背景知道一下也好的信息，所以写在这里。另外，通讯作者的专利申请是有好好披露的。
怎样才能成为质量更高的研究
- 增加 n，并事先确定检验的设计。特别是“不依赖温度”“不依赖时间”这类否定性结论，需要能证明等效性的设计，以及检验效能的说明
- 把图、表、正文的数值做机械式的逐一核对。上面列出的那些不一致，用投稿前的检查清单就能消灭
- 给出包封效率、Zeta电位、血清中稳定性的数值。只有尺寸和PDI，作为制剂的特性描述是不够的
- 与更特异的配体做比较。VLA-4适合做原理验证，但不适合评价选择性。如果与CD33或CLEC12A这样范围更窄的靶点并列比较，“靶向”的含义就会清楚起来
- 把患者来源细胞和正常造血前体细胞并列比较。正常细胞的摄取会增加多少，是从安全性角度想知道的数字
- 在直接点击的条件下也测包封效率和泄漏。这能为颗粒已经坏掉提供定量的支撑
艾克索太郎的视角
我老实说。这篇论文并不是我本人的专业。我所从事的，是用间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）以及从它分泌出来的细胞外囊泡（extracellular vesicle, EV），来治疗脊髓损伤等神经疾病。小儿白血病也好、LNP的制剂设计也好，都不是我亲手做过的领域。所以关于制剂化学的细节，我是和各位读者站在同一侧来读的。
即便如此我还是选了这篇论文，是因为这里写的东西会直接作用到我们这个领域上来。
第一点。post-insertion在外泌体的表面改造里也是照样在用的手法。想给EV定下靶向的研究者，会做出带肽或配体的脂质–PEG零件，再插进做好的EV里。思路也好、用到的零件也好，和这篇论文几乎一样。所以这篇论文给出的那些注意事项——插入的时机会改变颗粒的性质、能加进去的量存在上限、反应过程中结构可能被破坏——就成了处理EV的我们应该带回去的问题。老实说，要问我在给EV插上零件之后有没有仔细地重新测过尺寸分布，我是挺不起胸膛的。
第二点。而且这里是最重的一点。这篇论文真正的教训是“操作步骤无法跨越颗粒的种类搬移”这件事。作者们在结论里这样写：post-insertion的动力学和热力学在脂质体与LNP上可能不同，因此在一种颗粒上确立的步骤，不能轻易地搬到另一种颗粒上去。实际上，在脂质体上据称要花数小时〜48小时的反应，在LNP上30分钟就结束了；相对于理所当然含有总PEG 10%以上的脂质体，LNP能追加的PEG只到2%。透析前后这个差别，在脂质体上也是没有被报告过的。
那么EV又怎么样呢。EV在结构上拥有接近脂质体的脂质双层膜。但膜里密密麻麻地埋着以四跨膜蛋白为代表的膜蛋白，表面覆着一层蛋白质，而最要紧的是，它是活体做出来的，所以每一颗都不一样。它既不是脂质体也不是LNP，而是第三种颗粒。把这篇论文的论证方式老实地延长下去，结论就是：“EV会怎么样”这件事，不测EV就不会知道。
这个主张之所以有分量，是因为负责构思的 Schiffelers 以脂质体拿到博士学位，以细胞外囊泡获得ERC资助，又成为ISEV的创始成员——他是实际在这三种颗粒之间往来过的人。致谢里出现细胞外囊泡研究者 Pieter Vader 的名字，也告诉我们这篇论文是从什么样的土壤里长出来的。
第三点。把话拉回我本来的主题，还没有跨过去的距离也就清楚了。这篇论文处理的，是漂在培养液里的白血病细胞。待在血液里的细胞，对颗粒来说可以说是最容易到达的对象。而我们想送到的，是血脑屏障和血脊髓屏障另一侧的、受损的神经组织。贴地址的技术做好了，和能不能到达那个地址，是两个不同的问题。
不过就顺序而言，我认为这是对的。不把送达的技术钻研到位，只往前推进送到哪里的讨论，是成不了形的。它并不光鲜，但一定得有人去做。而这类工作的质量，几年之后会以另一篇论文的生存曲线的形式显现出来。实际上，就在这篇制剂论文的第二年，同一团队的生存数据出来了。
最后说一点写法上的事。这篇论文在自己的结果与脂质体的既有知识相互矛盾时，并没有写“脂质体的报告是错的”这种话，而是写“颗粒的种类不同，所以步骤搬不过去”。不去争哪一个正确，而是作为适用范围的问题来整理。这是朴素的态度，但我信任这样的写法。
※本文在人工智能的协助下撰写。