Ponerle «dirección» a las nanopartículas lipídicas (LNP) que transportan fármacos: no pegarla en la superficie, sino insertarla al final. Antes o después de la diálisis, el destino de la partícula cambia

Las nanopartículas lipídicas (lipid nanoparticle, LNP) se hicieron célebres con las vacunas de ARNm contra la COVID-19. Son transportistas que envuelven un ARN frágil en un grano de lípidos y lo llevan hasta el interior de la célula. A una vacuna basta con inyectarla en el músculo y, si actúa allí mismo y en los ganglios linfáticos cercanos, cumple su cometido; por eso la pregunta de «adónde llega» no era un gran problema.

La cosa cambia cuando se quiere apuntar únicamente a un tipo de célula. Una partícula que viaja por la sangre, si se la deja a su aire, termina acumulándose en el hígado. Si queremos especificar el destinatario —solo las células leucémicas, solo las neuronas—, hay que pegarle a la superficie de la partícula una «dirección»: un ligando o un anticuerpo que se una a la diana.

El trabajo que comentamos hoy se dedica de lleno a una sola cuestión, cómo se pega esa dirección. Puede sonar poco glamuroso, pero no sirve de nada escribir la etiqueta si al hacerlo aplastamos el paquete. Eso es exactamente lo que este artículo midió.

Dos advertencias antes de empezar. La primera: es un artículo de 2022. Lo traemos ahora porque es el cimiento que sostiene los experimentos en animales que el mismo grupo publicó en 2023 (volveremos a ellos) y porque la técnica que emplea es directamente continua con la funcionalización de superficie de los exosomas. La segunda: es un estudio en células y en tubo de ensayo. No hablamos de un tratamiento disponible para los pacientes.

Datos de la publicación

• Título del artículo: A robust post-insertion method for the preparation of targeted siRNA LNPs (Un método robusto de post-insertion para preparar LNP de siRNA dirigidas)
• Tipo de artículo: artículo original (estudio metodológico de formulación y liberación de fármacos)
• Revista: International Journal of Pharmaceutics, volumen 620, artículo 121741 (recibido el 1 de febrero de 2022, aceptado el 8 de abril, publicado en línea el 11 de abril)
• DOI / enlace: 10.1016/j.ijpharm.2022.121741
• Licencia: acceso abierto (CC BY 4.0). Cualquiera puede leer el texto completo
• Impact Factor: en torno a 5 de forma aproximada (varía según el año; es una revista especializada con una larga tradición en tecnología farmacéutica y liberación de fármacos)
• Autores: L.E. Swart (primera autora), C.A. Koekman, C.W. Seinen, H. Issa, M. Rasouli, R.M. Schiffelers y O. Heidenreich (autor de correspondencia); siete en total
• Afiliaciones: Centro de Oncología Pediátrica Princess Máxima (Utrecht, Países Bajos); Departamento de Química Clínica y Hematología del Centro Médico Universitario de Utrecht (UMC Utrecht); Wolfson Childhood Cancer Research Centre de la Universidad de Newcastle (Reino Unido); Departamento de Pediatría del Hospital Universitario de Fráncfort (Alemania)
• Financiación: beca de programa de KiKa, la organización neerlandesa de apoyo a la investigación del cáncer infantil (grant 329)
• Declaración de conflictos de interés: Heidenreich, el autor de correspondencia, tiene una solicitud de patente en trámite titulada «Targeted lipid nanoparticle formulations» (formulaciones de nanopartículas lipídicas dirigidas); según el texto del artículo, presentada a nombre del Centro de Oncología Pediátrica Princess Máxima

¿Qué clase de investigador es el autor de correspondencia?

El autor de correspondencia, Olaf Heidenreich, dirige un grupo de investigación en el Centro de Oncología Pediátrica Princess Máxima y es además catedrático de hematología molecular y responsable de la línea de cáncer infantil en la Universidad de Newcastle (Reino Unido). Su eje ha sido siempre el mismo: cómo atacar los «genes de fusión» que nacen del intercambio de fragmentos entre cromosomas en la leucemia. Entre ellos lleva más de veinte años siguiendo a RUNX1/ETO (que también se escribe RUNX1/RUNX1T1 o AML1/ETO), surgido de la translocación t(8;21). En 2003 publicó en Blood que, al suprimir AML1/MTG8 (es decir, RUNX1/ETO) con siRNA, las células leucémicas t(8;21) positivas se orientan hacia la diferenciación mieloide.

Un gen de fusión es una diana ideal, porque existe solo en la célula tumoral, y al mismo tiempo un rival difícil para los fármacos convencionales de molécula pequeña (en general se considera que una proteína formada por la fusión de dos factores de transcripción carece de un bolsillo profundo donde encajar un fármaco). De ahí la fuerza de la opción de apuntar por secuencia: el siRNA. Y para llevar ese siRNA hace falta un transportista; este artículo es el trabajo de poner ese transportista a punto.

El coautor Raymond M. Schiffelers (aquí a cargo de la conceptualización y la supervisión) es catedrático de nanomedicina en el UMC Utrecht. Conviene detenerse un momento en él, porque es la clave de todo esto. Su tesis doctoral (Universidad Erasmo de Róterdam, 1996–2001) versó sobre la direccionalidad de antibióticos mediante liposomas: es decir, se trata de un investigador criado en los liposomas. En 2010 obtuvo una beca del ERC con un proyecto de sistemas de liberación de fármacos inspirados en microvesículas; es miembro fundador de la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (International Society for Extracellular Vesicles, ISEV) y editor adjunto de Journal of Extracellular Vesicles. Una persona situada en el centro del mundo de las vesículas extracelulares participó desde la fase de concepción en un artículo de formulación sobre las LNP, que son nanopartículas sintéticas. Hay que aclarar, eso sí, que el artículo no menciona ni una sola vez las vesículas extracelulares: lo que compara son liposomas y LNP. Aun así, que la nómina de autores atraviese esos tres tipos de partícula enlaza con lo que diremos en la segunda mitad.

La primera autora, Laura E. Swart, se encargó de establecer el método, de los experimentos, del análisis y de la redacción del manuscrito, y firma también la continuación de 2023 que veremos más adelante.

¿Qué era, en realidad, lo que no se sabía hasta ahora?

Liposomas y LNP se parecen por fuera, pero por dentro son distintos

El veterano entre las nanopartículas que encapsulan fármacos es el liposoma: una bolsa hecha de la misma bicapa lipídica (lipid bilayer) que la membrana celular, con agua dentro. Se usa en la clínica desde la década de 1990.

Las LNP que transportan siRNA, en cambio, tienen otra arquitectura. Según el artículo, su interior es un núcleo esencialmente hidrófobo ocupado por micelas lipídicas dispuestas en sentido inverso, y son esas micelas las que envuelven el ácido nucleico. No es una bolsa de agua, sino un grano macizo. De hecho, en las imágenes de microscopía electrónica de este mismo artículo las LNP aparecen como esferas de interior oscuro y compacto.

👦 Estudiante: Si las dos son «granos de lípido», ¿no se pueden manejar igual?

🧬 Dr. Exotaro: Ahí está la trampa. Piense en el liposoma como un globo y en la LNP como un dango relleno de anko, ese dulce japonés macizo de pasta de judía dulce. Clavar un adorno en la membrana de un globo y clavarlo en la superficie de un dango son dos cosas muy distintas: cambia cómo entra y cambia cómo se desmorona todo después.

Ponerle una dirección a un liposoma es un procedimiento establecido: basta dotar al ligando de una cola lipídica para que esa cola se meta espontáneamente en la bicapa. Pero en una LNP no hay ninguna bicapa en la que meterse. Ese es el punto de partida del artículo.

Hay otra condición que respetar: el diámetro hidrodinámico de la partícula. Citando trabajos previos, el artículo llama «zona de Ricitos de Oro» al intervalo de 40〜150 nm. Por debajo, el riñón las filtra; por encima, no logran penetrar en el tejido. El tamaño no es un indicador secundario, sino la condición que decide si la partícula sirve o no sirve.

¿Cuál de las dos estrategias es la buena?

Lo que el artículo comparó son estas dos (figura 1 del artículo).

1. Modificación directa de la superficie: primero se fabrica la partícula y después se une el ligando directamente a los grupos reactivos que asoman en su superficie (figura 1A)
2. post-insertion, es decir, insertar la pieza después: se une por adelantado el ligando a un lípido para formar una sola pieza, y esa pieza se inserta en la partícula ya terminada (figura 1B)

Para unir las piezas eligieron una reacción clic y, además, de las que no usan cobre. Su nombre formal es cicloadición azida–alquino promovida por tensión (strain-promoted azide-alkyne cycloaddition, SPAAC).

👦 Estudiante: ¿Por qué hay que evitar el cobre?

🧬 Dr. Exotaro: El cobre(I) es un catalizador excelente, pero resulta tóxico para los seres vivos. Por eso se recurre a un alquino cíclico deliberadamente tensionado, el DBCO. Esa tensión eleva su energía y le permite reaccionar con una azida por su cuenta, sin catalizador. Al empujar el broche, hace clic y queda encajado: de ahí viene el nombre de la reacción clic.

Y la última variable es el momento. Después de fabricar la LNP viene un paso en el que se retira el etanol por diálisis. La diálisis no solo elimina el disolvente: también neutraliza la carga superficial y estabiliza la disposición de los lípidos, es decir, «madura» la partícula. ¿La dirección se pega antes o después de esa diálisis? Nadie lo había estudiado de forma sistemática.

¿Qué descubrió este trabajo?

Cómo se prepara: materiales y protocolo

La LNP de base se prepara disolviendo en etanol DLin-MC3-DMA (el lípido ionizable), DSPC, colesterol y los dos lípidos pegilados, DMG-PEG(2000) y DSPE-PEG(2000)-DBCO, en una relación molar de 50:10:38.5:1.2:0.3. Cuando iba a hacerse post-insertion, esa relación se cambió a 50:10:38.5:1.5:0.1 para dejar sitio a la pieza que se inserta.

El siRNA se diluye en ácido acético 25 mM (pH 4) hasta ajustar una relación N/P de 4 y se mezcla en un equipo de microfluídica, el NanoAssemblr Benchtop, con un caudal total de 4 ml/min y una relación de caudales lípido:siRNA de 1:3. Después se dializa frente a PBS a 4 ℃ durante toda la noche con una membrana de corte de 10 kDa, con lo que se elimina el etanol y se neutraliza la preparación.

La carga son dos siRNA distintos: siRE, el candidato real, dirigido al punto de fusión de RUNX1/ETO, y siMM, un control con desapareamiento en el que se han intercambiado dos bases. Usar como control una secuencia apenas modificada es el diseño básico para demostrar no «que la partícula entró», sino «que la secuencia funcionó». La pieza de la dirección se prepara con una relación molar DBCO:azida = 3:1 y toda la noche a temperatura ambiente. En la práctica, las piezas obtenidas se guardaron a 4 ℃ hasta 7 días antes de usarlas (sin que ese plazo se haya validado como periodo de conservación).

① Al conjugar directamente en la superficie, la partícula se desmoronó

Es el resultado más fácil de leer de todo el artículo. Se compararon cuatro condiciones midiendo tanto el tamaño por dispersión dinámica de luz (DLS) como el aspecto por criomicroscopía electrónica (cryoEM).

(Media ± desviación estándar, n = 3. PDI = índice de polidispersidad: cuanto más cerca de 0, más uniformes son las partículas)

Las imágenes de cryoEM explican qué significan esas cifras. En A las esferas macizas se alinean con orden, y en B la estructura del núcleo también se conserva. Pero en C, la conjugación directa en la superficie, la forma esférica se rompe, aparecen fragmentos de aspecto micelar e incluso partículas multilamelares grandes que parecen resultar de la fusión de varias LNP (los círculos blancos de la figura 2C del artículo). D, en cambio, mantuvo la esfericidad y el núcleo compacto.

👦 Estudiante: Ya en B estamos en 110 nm. Si solo se ha añadido DBCO, ¿por qué se hinchan?

🧬 Dr. Exotaro: La hipótesis del artículo es esta: cuando el DBCO no está unido a una azida, ese grupo acaba orientado hacia el interior de la partícula. Hay trabajos previos que describen cómo el PEG se mete dentro de la partícula durante el autoensamblaje, y aquí ocurriría lo mismo. O sea, que intentamos hacer reaccionar desde fuera un grupo que mira hacia dentro. Por eso resulta más natural montar la pieza primero e insertarla después, aunque el artículo no llegó a medir el mecanismo más allá de esa conjetura.

Esta tendencia no dependió ni del tipo de ligando ni del tipo de carga. En los datos suplementarios, con un VHH (nanocuerpo) como ligando y un código de barras de ADN como carga, el resultado fue el mismo: la post-insertion mantuvo el aumento de tamaño por debajo del 50%.

② El tamaño cambió según si era «antes o después» de la diálisis

Pasemos a la variable del momento. Con LNP marcadas con el fluorocromo Cy3 se prepararon dos series con distinta cantidad de PEG (DMG-PEG 1.5% y 1.2%).

(Media ± desviación estándar, n = 3. Los valores de p corresponden a la prueba t de Student bilateral. El artículo no especifica qué se compara con qué, pero, como la fila «después de la diálisis» aparece vacía, cabe leerlo como una comparación tomando esa fila por referencia)

La tendencia es nítida: si se añade antes de la diálisis se superan con holgura los 100 nm, y si se inserta después se obtiene el tamaño más pequeño. El artículo lo resumió diciendo que «el momento de la eliminación del disolvente resultó decisivo».

También apareció una diferencia según la cantidad de PEG. En la serie del 1.2%, incluso insertando después de la diálisis el PDI subió de 0.136 a 0.246, mientras que en la del 1.5% apenas se movió: de 0.147 a 0.161. La discusión lo atribuye a que una LNP con poco PEG es de por sí inestable y propensa a agregarse, de modo que las partículas se juntan durante la propia post-insertion. A partir de ahí los autores adoptaron el 1.5% de DMG-PEG como condición estándar. Eso sí, la columna de los valores de p merece atención: ninguna de las comparaciones de la serie del 1.5% alcanza el umbral de significación. Volveremos sobre ello en la segunda mitad.

👦 Estudiante: ¿Qué es lo que mide exactamente el PDI?

🧬 Dr. Exotaro: La uniformidad de las partículas. Cuanto más cerca de 0, más iguales son de tamaño; cuanto más alto, más desigual es la población. En formulación se le da tanta importancia como al tamaño medio, porque una población con partículas grandes y pequeñas mezcladas se comporta de forma menos previsible dentro del organismo y además es menos estable como producto.

③ Funciona en cualquier punto del intervalo 25〜55 ℃ y termina en 30 minutos

En los liposomas se ha descrito que la eficiencia de la post-insertion depende mucho de la temperatura y que está gobernada por la temperatura de transición de fase de los lípidos. ¿Y en las LNP?

A unas LNP cargadas con siRNA marcado con Cy5 se les hizo reaccionar una pieza marcada con Cy3 a 25, 35, 45 y 55 ℃, dos horas en cada caso. Lo ingenioso es haber usado fluorocromos distintos para el siRNA y para la pieza que se inserta. La eficiencia se juzgó por la coelución en FPLC: en una columna de Sepharose CL-4B, las LNP grandes salen antes y las micelas libres, pequeñas, salen más tarde. El montaje es este: si la pieza está insertada, el pico de Cy3 se superpone al de Cy5; si sobra pieza, aparece un pico aparte y retrasado.

El resultado: a todas las temperaturas el pico de Cy3 se superpuso por completo al de Cy5. Los tamaños se mantuvieron en 64〜79 nm, un nivel que no puede considerarse un aumento respecto a la LNP desnuda (78 nm) (n = 2, con los datos dados como media e intervalo). Como temperatura estándar para lo sucesivo se fijaron 45 ℃.

El tiempo se estudió con la misma lógica: 0, 0.5, 1 y 2 horas a 45 ℃. Solo en la muestra de 0 horas quedó un pequeño pico de Cy3; en las demás la superposición fue total. Y aquí el propio artículo añade una nota que da gusto leer: la muestra de «0 horas» tarda también 10 minutos en inyectarse y atravesar la columna. Es decir, lo más probable es que la reacción ya haya terminado en esos 10 minutos. Por eso los autores concluyeron que «se completa en menos de 30 minutos».

En los liposomas el tiempo óptimo se cifra en 2〜4 horas y, según algunos informes, llega hasta 48 horas. Una LNP que termina en 30 minutos es de 4〜8 veces más rápida que ese óptimo y, frente a los informes más largos, más rápida en un orden de magnitud. En la práctica, la diferencia es considerable.

④ Hay un límite para el PEG que se puede meter

¿Hasta dónde se puede llegar a cargar, entonces? Se hizo reaccionar la pieza marcada con Cy3 durante 30 minutos a 45 ℃, variando su proporción desde el 0.5% hasta el 4%.

(Media ± desviación estándar, n = 3)

Hasta el 2% (un PEG total del 3.5%) todo encaja limpiamente. Pero por encima del 2% de PEG añadido, la pieza que no logra insertarse aparece como micelas libres y la propia LNP empieza a romperse. De hecho, los tamaños se dispararon a 215 ± 269 nm con el 3% y a 565 ± 164 nm con el 4%. El artículo sitúa el techo entre un 2% y un 3% de PEG añadido y señala que, para el uso práctico, basta con un 0.1〜0.3% de PEG adicional.

Aquí vuelve a aparecer la distancia con los liposomas. Un liposoma contiene sin ningún problema un PEG total superior al 10%, y el techo de la post-insertion se ha situado en torno al 10% de PEG total. En una LNP, en cambio, el techo llega con un 2〜3% de PEG añadido (lo que equivale a un total del 3.5〜4.5%). Como una cifra se refiere al «total» y la otra a lo «añadido», no cabe una comparación directa de factores, pero la conclusión es que la LNP acepta bastante menos PEG que el liposoma.

⑤ El marcaje no reduce la eficacia, y con dirección la captación se acelera

Queda la comprobación biológica. Se usaron Kasumi-1 y SKNO-1, dos líneas celulares de leucemia mieloide aguda (AML) humana que portan la t(8;21) y expresan RUNX1/ETO.

Primero, la pregunta de si el fluorocromo resta eficacia. Se administró siRE con LNP marcadas y sin marcar con Cy3 y, 24 horas después, se midieron por qPCR los transcritos de RUNX1/ETO. Ambas mostraron una reducción de unas 2 veces frente al control con desapareamiento (así lo expresa el artículo; aproximadamente la mitad que el control), sin diferencias significativas entre marcadas y sin marcar (el «ns» de la figura 6A). La etiqueta fluorescente no estorba al efecto.

Y ahora lo principal. El ligando empleado aquí es LDV, una molécula que se une a VLA-4 (la integrina α4β1), y VLA-4 se expresa ampliamente en las células del sistema hematopoyético. Se insertaron dos piezas distintas en una misma partícula —Cy3 para el seguimiento y LDV para el direccionamiento— y se siguió la captación por citometría de flujo. Midiéndola a las 1, 3, 6 y 24 horas, las LNP con LDV se captaron de forma significativamente mayor que las que no lo llevaban (n = 4, ANOVA de dos vías; la significación no se da punto por punto, sino como una comparación entre grupos, con y sin direccionamiento). Esa diferencia se reflejó también en la rapidez con que arranca el silenciamiento de RUNX1/ETO (figura 6C; ese experimento se hizo a 0.1 µg/ml).

👦 Estudiante: ¿Qué tiene de bueno poder poner dos direcciones?

🧬 Dr. Exotaro: Dos cosas. La primera, que se puede separar el seguimiento del direccionamiento: el fluorocromo que dice «adónde fue» y el ligando que decide «adónde va» se diseñan de forma independiente. La segunda es una aplicación que el propio artículo sugiere: llegar a dianas difíciles que solo permiten la entrada cuando se unen dos receptores a la vez. La imagen es la de una puerta que no se abre si no se usan dos llaves.

¿Cómo cambiará el futuro? (el camino hacia la clínica)

¿Qué se ha podido construir con este método? La continuación

La metodología de formulación, por sí sola, no permite medir la distancia hasta la clínica. Por suerte, este artículo tiene continuación. Al año siguiente, en 2023, el mismo grupo publicó en Leukemia el trabajo «Nanoparticle-mediated targeting of the fusion gene RUNX1/ETO in t(8;21)-positive acute myeloid leukaemia» (Issa H, Swart LE y cols., Leukemia 2023, vol. 37, n.º 4, págs. 820–834, DOI: 10.1038/s41375-023-01854-8). Tanto Issa, que firma en primer lugar, como Swart son autores del artículo de hoy.

Según el resumen, al silenciar transitoriamente RUNX1/ETO con LNP cargadas de siRNA disminuyó su unión a los genes diana y cambió también la unión de RUNX1 y de su cofactor CBFβ. Además, la supervivencia mediana de un modelo murino de AML con t(8;21) se prolongó de forma notable y, más aún, ese silenciamiento transitorio produjo una inhibición duradera de la capacidad de proliferación y de formación de colonias de las células leucémicas, indujo diferenciación mieloide y redujo drásticamente su capacidad de retrasplante. Los autores lo resumieron diciendo que habían demostrado «la viabilidad preclínica de atacar el gen de fusión». Basta golpear una sola vez, de forma transitoria, para que el efecto dure. El artículo de formulación que comentamos hoy era el cimiento que hizo posible ese experimento.

👦 Estudiante: ¿Entonces el tratamiento está cerca?

🧬 Dr. Exotaro: No, seguimos en fase preclínica. Entre alargar la supervivencia de un ratón y funcionar en un paciente hay un abismo. En humanos esperan el problema del sesgo de las partículas hacia el hígado, la reacción inmunitaria frente al PEG cuando se administra de forma repetida y la dificultad de llegar a un lugar tan poco accesible como la médula ósea. Dicho esto, es cierto que la idea de que «un gen de fusión se puede atacar por secuencia» va ganando sustancia.

Lo que significa visto desde la planta de producción

Lo que de verdad pesa en la práctica es que con la post-insertion la dirección se pega al final del proceso. Los anticuerpos y los nanocuerpos son caros y frágiles tanto frente al calor como frente a los disolventes orgánicos: si se mezclan desde el principio, hay que hacerlos pasar íntegros por el mezclado y por la diálisis. Basta una reacción de 30 minutos a 45 ℃ sobre la partícula ya terminada para pegar la dirección, y la carga tampoco se escapa (eso sí, después de la reacción viene otra noche de diálisis, así que el proceso completo no se resuelve en 30 minutos). Fabricar un mismo soporte en gran cantidad y cambiar solo la dirección según el uso: eso es modularidad. Si no hay que rehacer la línea de producción para cada diana, la estructura de costes del desarrollo cambia.

Cómo leer este trabajo con ojo crítico (límites y vías para elevar su calidad)

Lo que hay que reconocerle

Seamos justos primero. El diseño de la comparación es correcto: el clic directo y la post-insertion se ponen uno al lado del otro con el mismo soporte, el mismo ligando y la misma carga. Se verifica con cifras y con imágenes: el tamaño se cuantifica por DLS, y la forma y la estructura interna se miran directamente por cryoEM. Como la medida por DLS se deja arrastrar por las partículas grandes, respaldarla con imágenes tiene todo el sentido (aunque no se cuantifica la distribución de tamaños a partir del cryoEM). El criterio con que se juzga la eficiencia de la reacción es diáfano: marcar la partícula y la pieza con fluorocromos distintos y mirar si los picos se superponen es un diseño que no fuerza nada. Y, por último, se comprueba que la carga no se escapa: si el contenido se sale al pegar la dirección, todo lo demás sobra.

Lo que conviene leer con cuidado

① El respaldo estadístico es débil. Las comparaciones de la serie del 1.5% en la tabla 2 dan p = 0.13, 0.33 y 0.099: ninguna alcanza el umbral de significación (y, de nuevo, el artículo no especifica qué compara cada valor de p; lo deducimos de que la fila «después de la diálisis» esté vacía). Es decir, una de las afirmaciones centrales del trabajo —que antes de la diálisis la partícula se hincha más del doble— no está respaldada estadísticamente en la serie del 1.5%, que es precisamente la adoptada como condición estándar. Donde sí hubo diferencias significativas fue en la serie del 1.2%, la que los propios autores descartaron por inestable.

② La n es pequeña, lo que debilita las conclusiones negativas. Las tablas 1, 2 y 4 se hicieron con n = 3, y las tablas 3 y 5 con n = 2, además informadas como media e intervalo en lugar de con desviación estándar. Sostener con dos mediciones conclusiones negativas del tipo «no depende de la temperatura» o «no depende del tiempo» exige prudencia: no se puede distinguir entre que no haya diferencia y que no haya potencia para detectarla. A ello se añade que, en la condición del 3% de la tabla 4, 215 ± 269 nm tiene una desviación estándar mayor que la media; sirve como indicio indirecto de que la partícula está rota, pero no permite leer «con el 3% el tamaño es este».

③ Las tablas 3 y 5 contienen las mismas cifras. La LNP 1.0 de la tabla 3 y la LNP 2.0 de la tabla 5 son ambas 78 [65, 90] nm con un PDI de 0.205 [0.144, 0.266]; y la condición de 45 ℃ durante 2 horas de la tabla 3 y la de 2 horas de la tabla 5 son ambas 64 [60, 68] nm con un PDI de 0.197 [0.174, 0.219]. Lo natural es entenderlo como la reproducción del mismo experimento, pero no hay ninguna advertencia al respecto, lo que deja margen para tomarlos por experimentos independientes.

④ Hay discrepancias entre el texto, las tablas y las figuras. Como pueden causar un perjuicio real a quien intente reproducir el trabajo, las detallamos.

• El tiempo de reacción de la figura 5 no coincide entre la figura y su leyenda. La flecha de la figura 5B lleva dibujado «30 min at 45 °C», mientras que la leyenda de esa misma figura dice que «la reacción se realiza a 45 ℃ durante 2 horas». La conclusión del texto principal es «30 minutos a 45 ℃». En la figura que debería mostrar el protocolo optimizado, el tiempo no cuadra.
• Hay varios puntos en los que las referencias y las cifras no concuerdan con las tablas. La leyenda de la tabla 1 dice que «los símbolos corresponden a las imágenes de cryoEM (figura 1)», pero el cryoEM está en la figura 2. Cuando el texto afirma que «el diámetro aumentó un 50% (tabla 1, segunda y cuarta entradas)», la segunda es 110 nm y la cuarta 93 nm, de modo que en realidad disminuye (el aumento de alrededor del 50% sale al compararla con la primera, de 63 nm). Lo mismo ocurre con «aumentó entre un 10〜30% las LNP con 1.5% de PEG»: la comparación correspondiente en la tabla 2 va de 66 nm a 93 nm, es decir, un aumento de alrededor del 41%. Y la condición del 3%, que el texto describe como «una media de 218 nm», figura en la tabla 4 como 215 ± 269 nm.

Ninguna de ellas invalida las conclusiones y todas son del tipo de error que se corrige en una revisión de pruebas. Pero, como el valor de un artículo de protocolo está en que se pueda fabricar exactamente lo que describe, para quien intenta reproducirlo no son problemas menores.

⑤ No hay que confundirse con lo que aquí significa el direccionamiento. VLA-4, la diana a la que se une LDV, se expresa «ampliamente en las células hematopoyéticas», como escribe el propio artículo. No es una diana específica de las células leucémicas. Lo que este experimento demostró no es que se pudiera apuntar solo a las células leucémicas, sino un principio: que al poner la dirección la captación se acelera y el efecto arranca antes. El artículo tampoco afirma más que eso, pero es un punto en el que al lector le resulta fácil mezclar las cosas.

⑥ Todo ocurre en el tubo de ensayo y en células. No hay experimentos con animales. Solo se usan dos líneas celulares y ninguna célula procedente de pacientes. La estabilidad en suero, el tiempo de permanencia en sangre o la reacción inmunitaria, factores que pesan más que el tamaño a la hora de decidir el destino clínico, quedan fuera del alcance de este trabajo. Además, aunque el método para medir la eficiencia de encapsulación aparece en el capítulo de métodos, las tablas del texto no indican qué porcentaje se obtuvo realmente. Y el tiempo de almacenamiento hasta la medición, «hasta 7 días», es un margen amplio que puede contribuir a la variabilidad.

⑦ Un contexto que el artículo no recoge y que es información pública. Según el perfil público de su institución, el coautor Schiffelers ejerce como editor de International Journal of Pharmaceutics, la revista en la que se publicó este trabajo. No consta en el apartado de conflictos de interés. Las revistas académicas tienen procedimientos estándar para gestionar los manuscritos en los que participa alguien vinculado a la redacción, de modo que esto por sí mismo no implica ninguna irregularidad; lo dejamos escrito porque nos parece información que al lector le conviene conocer como telón de fondo. La solicitud de patente del autor de correspondencia, por su parte, está declarada con toda claridad.

¿Qué habría hecho de esta una investigación de mayor calidad?

• Aumentar la n y decidir de antemano el diseño de los contrastes. Las conclusiones negativas del tipo «no depende de la temperatura» o «no depende del tiempo» exigen, en particular, un diseño de equivalencia y una declaración de la potencia estadística
• Cotejar de forma mecánica las cifras de las figuras, las tablas y el texto. Las discrepancias señaladas arriba se atrapan con una lista de verificación antes del envío
• Dar cifras de eficiencia de encapsulación, potencial zeta y estabilidad en suero. Con el tamaño y el PDI por sí solos, la caracterización de la formulación queda incompleta
• Comparar con ligandos más específicos. VLA-4 sirve para la prueba de principio, pero no para evaluar la selectividad; ponerlo al lado de dianas más restringidas, como CD33 o CLEC12A, aclararía qué significa aquí «direccionamiento»
• Poner en paralelo células procedentes de pacientes y progenitores hematopoyéticos normales. Cuánto aumenta la captación en las células normales es una cifra que interesa conocer desde el punto de vista de la seguridad
• Medir también la eficiencia de encapsulación y la fuga en la condición de clic directo. Daría respaldo cuantitativo a la afirmación de que la partícula está rota

La perspectiva del Dr. Exotaro

Seré sincero: este artículo no es exactamente mi especialidad. Yo me dedico al tratamiento de enfermedades neurológicas, empezando por la lesión medular, con células madre mesenquimales (mesenchymal stem cell, MSC) y con las vesículas extracelulares (extracellular vesicle, EV) que estas liberan. Ni la leucemia infantil ni el diseño de formulaciones de LNP son terrenos en los que haya trabajado con mis propias manos. Así que, en los detalles de la química farmacéutica, leo este trabajo desde el mismo lado que ustedes.

Y, aun así, lo he elegido porque lo que aquí se cuenta repercute directamente en nuestro campo.

Lo primero: la post-insertion es exactamente la misma técnica que se usa para funcionalizar la superficie de los exosomas. Quien quiere dirigir unas EV fabrica una pieza de lípido–PEG con un péptido o un ligando y la inserta en las EV ya formadas. Ni el planteamiento ni las piezas se diferencian apenas de los de este artículo. Por eso las advertencias que deja —el momento de la inserción cambia las propiedades de la partícula, la cantidad que se puede meter tiene un techo, la estructura puede romperse durante la propia reacción— son preguntas que quienes trabajamos con EV deberíamos llevarnos a casa. Y, si he de ser honesto, no puedo sacar pecho y decir que después de insertar una pieza en unas EV hayamos vuelto a medir con cuidado la distribución de tamaños.

Lo segundo, y aquí está lo que más pesa: la verdadera lección de este artículo es que un protocolo no se traslada de un tipo de partícula a otro. Los autores lo escriben en sus conclusiones: la cinética y la termodinámica de la post-insertion pueden diferir entre liposomas y LNP, de modo que no se puede llevar a la ligera a una partícula un procedimiento establecido en la otra. De hecho, una reacción que en los liposomas se cifra en varias horas o hasta 48 horas se termina en 30 minutos en las LNP; y frente a un liposoma que contiene sin problema más del 10% de PEG total, a una LNP solo se le puede añadir un 2%. La diferencia entre antes y después de la diálisis es, además, algo que en los liposomas no se ha descrito.

¿Y qué ocurre entonces con las EV? Estructuralmente, las EV tienen una bicapa lipídica próxima a la del liposoma. Pero su membrana está densamente poblada de proteínas de membrana, empezando por las tetraspaninas; su superficie está cubierta por una capa de proteínas; y, sobre todo, como las fabrica un ser vivo, cada partícula es distinta de la siguiente. No son liposomas ni LNP: son un tercer tipo de partícula. Si prolongamos sin más el razonamiento de este artículo, la consecuencia es que qué ocurre con las EV no se sabrá hasta medirlo en las EV.

Esta afirmación tiene peso porque quien se encargó de la conceptualización, Schiffelers, se doctoró con liposomas, obtuvo una beca del ERC con vesículas extracelulares y fue miembro fundador de la ISEV: alguien que de verdad ha ido y venido entre los tres tipos de partícula. Que en los agradecimientos aparezca el nombre de Pieter Vader, investigador de vesículas extracelulares, también nos dice de qué suelo salió este trabajo.

Lo tercero: si lo acerco a mi propio tema, queda igual de clara la distancia que todavía no se ha cubierto. Lo que este artículo manejó son células leucémicas flotando en medio de cultivo. Una célula que vive en la sangre es, para una partícula, el destinatario más accesible que existe. Lo que nosotros queremos alcanzar, en cambio, es el tejido nervioso lesionado que está al otro lado de la barrera hematoencefálica y de la barrera hematomedular. Que la técnica de escribir la dirección esté a punto y que se pueda llegar al domicilio de esa dirección son dos problemas distintos.

Con todo, creo que el orden es el correcto. Discutir solo el destino sin haber afinado la técnica de la entrega no acaba en nada concreto. Es un trabajo poco vistoso, pero alguien tiene que hacerlo sin falta. Y la calidad de un trabajo así reaparece unos años más tarde como la curva de supervivencia de otro artículo. De hecho, al año siguiente de este trabajo de formulación salieron los datos de supervivencia del mismo grupo.

Una última cosa sobre la forma de escribir. Cuando sus resultados chocaron con lo que ya se sabía de los liposomas, este artículo no escribió que los informes sobre liposomas estuvieran equivocados: escribió que, siendo distinto el tipo de partícula, el protocolo no se traslada. No se trata de quién tiene razón, sino de ordenar el asunto como una cuestión de ámbito de aplicación. Es una actitud discreta, pero es la clase de escritura en la que yo confío.

Nota: este artículo se ha redactado con la ayuda de IA.