Cuando hablamos de las pequeñas bolsas que las células expulsan al exterior —las vesículas extracelulares (extracellular vesicle, EV)—, el papel protagonista suele recaer en los «exosomas», de unos 50–150 nanómetros de diámetro. En este sitio hemos tratado muchas veces cómo actúan esas partículas.
Pero la protagonista del artículo de hoy es una bolsa de más de 600 nanómetros de diámetro. Las más grandes alcanzan 1–2 micrómetros. Una bolsa del tamaño de una bacteria entera que se desprende de la célula. Los autores la denominan vesícula extracelular extragrande (extra-large extracellular vesicle, XLEV).
Y en esa bolsa iba cargado el sonic hedgehog (SHH), la molécula de señalización que decide la forma del cuerpo y que aparece sin falta en los libros de embriología. Cuando se aplicaron a células vasculares las EV recogidas de un sobrenadante de cultivo rico en estas bolsas, los esbozos de vasos aumentaron de forma clara: eso es lo que cuenta el artículo (pero, como detallaré más adelante, no fue un experimento en el que se aislaran y administraran únicamente las XLEV).
Lo más interesante era el sentido del interruptor que hace salir las bolsas. En la secreción de EV se ha insistido durante mucho tiempo en que «las proteínas Rab trabajan en estado ON (la forma que sujeta GTP)». Pero en este artículo era el estado OFF (la forma que sujeta GDP) el que hacía salir las bolsas grandes. En palabras de los propios autores, se trata de una lógica opuesta a la de los modelos clásicos, que dan prioridad a la forma unida a GTP.
Antes de seguir, una advertencia. Esto es un estudio hecho en células en cultivo. No se ha llegado a comprobar el efecto administrándolo a animales, ni se trata de un tratamiento utilizable en pacientes. Dicho eso, como trabajo de base sobre «cómo fabrica la célula sus bolsas y por dónde las saca», creo que merece la pena leerlo.
Datos de la publicación
- Título del artículo: Unconventional Secretion of Angiogenic Sonic Hedgehog–Containing Extra-Large Extracellular Vesicles is Driven by PI3K–Rab18-GDP Signalling (La secreción no convencional de «vesículas extracelulares extragrandes» que contienen sonic hedgehog proangiogénico está impulsada por la señalización PI3K–Rab18-GDP)
- Tipo de artículo: artículo original (biología celular; mecanismos de biogénesis de vesículas extracelulares)
- Revista: Journal of Extracellular Biology, volumen 5, número 2, artículo e70112 (recibido el 10 de julio de 2025, revisado el 3 de enero de 2026, aceptado el 7 de enero y publicado en línea el 28 de enero)
- DOI / enlace: 10.1002/jex2.70112
- Licencia: acceso abierto (CC BY). Cualquiera puede leer el texto completo
- Sobre la revista: es una revista especializada relativamente nueva, fundada en 2021 como la segunda publicación de la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (International Society for Extracellular Vesicles, ISEV) y lanzada en enero de 2022 (la primera es Journal of Extracellular Vesicles, en circulación desde 2012). La edita Wiley Periodicals, LLC. Es una revista de acceso abierto completo y sus tasas de publicación (APC) se anuncian en un máximo de 3,340 dólares estadounidenses
- Impact Factor: la página de la editorial indica 4.8 (aunque no especifica el año de referencia: parece ser el primer IF, basado en los datos de citación de 2025 publicados en el Journal Citation Reports de junio de 2026, pero no he podido confirmar ninguna página oficial que indique el año de forma explícita). Está indexada en PubMed/PMC, pero la indexación en MEDLINE no aparece en el catálogo de la Biblioteca Nacional de Medicina de los Estados Unidos
- Autores: cuatro en total: Shuo Wang (primer autor), Rio Imai, Yuya Kaneko y Yosuke Tanaka (autor corresponsal)
- Filiación: Laboratorio de Arquitectura Celular (área de Dinámica Celular Molecular), Departamento de Biología Celular y Anatomía, Escuela de Posgrado de Medicina, Universidad de Tokio
- Financiación: Programa GAP Fund de la Universidad de Tokio (8.ª, 12.ª y 14.ª convocatorias), AMED (JP22ym0126805, JP25ym0126805j0004, a través del Centro de Promoción de Investigación Clínica del Hospital de la Universidad de Tokio), KAKENHI de la JSPS (20K06634, 25K09626) y AMED BINDS (JP25ama121002). El GAP Fund es un programa de ayudas interno de la Universidad de Tokio que apoya la «verificación de la viabilidad práctica (prueba de concepto) con vistas a la comercialización»
- Declaración de conflictos de interés: el autor corresponsal, Tanaka, y el primer autor, Wang, tienen una patente en tramitación relacionada con este trabajo (solicitud japonesa 2022-078750, estadounidense 18/864610 y europea 23803594.3). Los demás autores declaran no tener ninguno. Como contaré más abajo, el contenido de esta patente afecta a cómo se lee el artículo, así que volveré sobre ello
- Disponibilidad de datos: se facilitan «en respuesta a una solicitud razonable» dirigida al autor corresponsal
¿Qué clase de investigador es el autor corresponsal?
El autor corresponsal, Yosuke Tanaka, es profesor titular (lecturer, PI) en la Escuela de Posgrado de Medicina de la Universidad de Tokio, y dirige desde septiembre de 2018 el laboratorio de Dinámica Celular Molecular / Arquitectura Celular. Se licenció en Medicina en la Universidad de Tokio, continuó en su escuela de posgrado y obtuvo el doctorado en Medicina en 1999. Si hubiera que resumir en una frase el eje de su investigación, serían las proteínas motoras que transportan cargas dentro de la célula.
Trabajó durante años en el laboratorio de Nobutaka Hirokawa, conocido en todo el mundo por sus estudios sobre las cinesinas: fue ayudante de investigación de 1996 a 2017 y profesor titular desde 2017. En los registros de KAKENHI figura como investigador colaborador en proyectos de Hirokawa, entre ellos sus Specially Promoted Research, entre 1996 y 2015 (Hirokawa no firma el artículo de hoy). Si se ponen en fila los artículos que ha publicado como primer autor, el trasfondo de este trabajo se ve como una sola línea continua.
- 1998, Cell — en ratones carentes de la cadena pesada de cinesina KIF5B, las mitocondrias se acumulan de forma anómala alrededor del núcleo (Tanaka Y, et al. Cell 1998;93(7):1147-1158). «Si falta el motor, los orgánulos se arriman al centro»: el prototipo de la misma lógica que está en el corazón del artículo de hoy.
- 2005, Nature — este es el antecedente más importante de todos. En el «nódulo» del embrión de ratón descubrió que, con la señal FGF como desencadenante, se secretan objetos envueltos en membrana de 0.3–5 micrómetros de diámetro, a los que llamó nodal vesicular parcel (NVP). Su contenido es sonic hedgehog y ácido retinoico (Tanaka Y, Okada Y, Hirokawa N. Nature 2005;435:172-177). Formaban parte del mecanismo que decide la izquierda y la derecha del cuerpo.
- 2022, Developmental Cell — en las extremidades anteriores de ratones con función reducida de KIF3B, los gradientes de señalización FGF/PI3K y de Shh se alteran y aparece polidactilia; además, la intensidad de la señal PI3K reparte el destino de Shh (Wang S, Tanaka Y, et al. Dev Cell 2022;57:2273-2289). Wang, el primer autor del artículo de hoy, también firma aquí en primer lugar.
- 2024, EMBO Reports — la cinesina 1 ayuda a plegar el canal de calcio CaV1.2 en el retículo endoplásmico y mantiene la homeostasis de la glucemia en el ratón (Tanaka Y, et al. EMBO Rep 2024;25:4777-4802). La chaperona Hsp90 vuelve a ser aquí una de las protagonistas.
Así que el artículo de hoy es, en definitiva, el trabajo que persigue hasta el nivel molecular, en células en cultivo, cómo se fabrica y por dónde sale esa «bolsa grande que transporta SHH» que él mismo encontró hace unos 20 años dentro del embrión. Cinesinas, Hsp90, SHH, «orgánulos que se arriman al núcleo»: los materiales con los que este investigador ha trabajado toda su carrera se reúnen aquí casi tal cual.
Una faceta más, ajena a la investigación: Tanaka es también poeta. Con el libro de poemas Pinku no sunabukuro («El saco de arena rosa», Shichōsha, 2021) ganó el 37.º Premio Shiika Bungakukan, y la presentación de galardonados del Museo Japonés de Poesía Moderna lo describe como «poeta y biólogo celular».
Para empezar, ¿qué era lo que no sabíamos hasta ahora?
Las bolsas tienen «clases de tamaño»
Las vesículas extracelulares no son una población homogénea. La guía MISEV2023, que la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV) publicó en 2024, propone que, cuando se las nombre por el tamaño, se usen las denominaciones operativas EV pequeñas (small EV, en general por debajo de 200 nanómetros) y EV grandes (large EV, en general por encima de 200 nanómetros), y recomienda que los términos que presuponen un modo de formación, como «exosoma», no se empleen si ese modo de formación no se ha comprobado de verdad (Welsh JA, et al. J Extracell Vesicles 2024;13:e12404).
La mayor parte de la investigación se ha concentrado en el lado pequeño. La razón es simple: son más fáciles de manejar. Se recogen bien por centrifugación y caben dentro del rango que cubren los equipos de medida más habituales. Dicho al revés, es posible que las bolsas grandes, de más de 600 nanómetros, hayan quedado descartadas por el propio procedimiento experimental. Donde este artículo se ha metido es justamente en ese lado descartado.
Sonic hedgehog no puede llegar lejos por su cuenta
Durante el desarrollo, SHH forma un gradiente de concentración —más denso aquí, más diluido allá— que indica la posición: «esto será un dedo, esto será la palma». Pero esta proteína está modificada con lípidos. Al llevar unidos colesterol y ácido palmítico, no está hecha para flotar a la deriva ella sola en un medio acuoso.
👦 Estudiante: ¿Y por qué es un problema que lleve lípidos?
🧬 Exotaro: Si dejas caer en agua la tinta de un rotulador permanente, no se dispersa: se queda hecha una bola. Con SHH pasa lo mismo, y tal cual no llega lejos dentro del agua. Por eso parece que la célula recurre a un truco: cargarlo en una barquita de membrana y mandarlo así. El NVP que se descubrió en 2005 era justamente esa barquita.
En 2018, otro grupo informó también de la existencia de EV especiales cargadas con SHH: una población que lleva como marcadores tres proteínas —Axl, Rab18 y Tmed10— y a la que sus autores llamaron ART-EV (Coulter ME, et al. Cell Rep 2018;24:973-986). Entre esos marcadores está Rab18: ahí empieza la historia de hoy.
Rab, una «etiqueta de ON/OFF»
Las Rab son una familia de proteínas pequeñas que gobiernan la logística dentro de la célula. Cuando sujetan una molécula de GTP están en ON; cuando ese GTP se hidroliza a GDP, en OFF. Según estén en ON o en OFF, cambian las parejas a las que se unen (los efectores).
En lo que respecta a la secreción de EV, se ha dado prioridad hasta ahora a la idea de que «el que trabaja es el lado ON». El ejemplo de referencia es Rab27a, conocida por acoplar el cuerpo multivesicular a la membrana plasmática y hacer que se liberen los exosomas (Ostrowski M, et al. Nat Cell Biol 2010;12:19-30).
Aun así, para ser justos, tampoco es tan sencillo como «solo el ON». El propio artículo escribe en su discusión que en la secreción de EV pequeñas intervienen tanto Rab7 en forma GDP como Arl13b/Rab27a en forma GTP: las dos cosas. Por eso la novedad de este estudio no consiste en «haber dado la vuelta por completo a la doctrina de la secreción de EV», sino en un único punto: que la liberación de las bolsas grandes la impulsaba la forma OFF de Rab18.
👦 Estudiante: ¿Entonces las Rab en OFF no hacen nada?
🧬 Exotaro: Normalmente se piensa eso, que OFF es la postura de «esperar el turno». Pero este artículo informa de que la forma OFF era precisamente el detonante que hace salir las bolsas grandes. Ese fue el mayor motivo de sorpresa esta vez.
¿Qué se descubrió en este artículo?
La pista estaba en «un fármaco que detiene las Rab»
Los autores empezaron aplicando dos fármacos a células madre mesenquimales (mesenchymal stem cell, MSC) humanas derivadas de médula ósea: CID1067700 (en adelante CID, a 40 micromolar) y SF1670 (a 250 nanomolar). El segundo inhibe la enzima PTEN y, como consecuencia, refuerza la señalización por debajo de PI3K.
Al recoger y analizar lo que salía al medio de cultivo, apareció una diferencia clara.
- TSG101, marcador de las EV pequeñas, aparece incluso sin fármaco (control con DMSO)
- En cambio, SHH solo se detectó cuando se aplicaron SF1670 y CID
Además, al fraccionar en un gradiente de densidad el sobrenadante de hMSC tratadas con CID, las partículas que contenían SHH se concentraron en fracciones más densas (las número 8–10) que las EV pequeñas CD81-positivas, mientras que CD81 apareció en las fracciones ligeras (2–7). Es decir, son cosas distintas.
En el análisis de seguimiento de partículas (NTA), las partículas de más de 600 nanómetros se detectaron en 3 de 3 ensayos en el grupo SF1670 y en 3 de 3 en el grupo CID, mientras que en el control con DMSO no se detectaron en ninguna de las 3 veces (p = 0.01, prueba de chi cuadrado). Las partículas por debajo de 600 nanómetros aparecen en todas las condiciones. También con microscopía electrónica —aquí las muestras son de hTERT-MSC inmortalizadas (UE7T-13)— el tratamiento con CID hizo que aumentaran de forma llamativa las bolsas de más de 600 nanómetros con contenido poco denso, y la mayoría de ellas estaban envueltas en una bicapa lipídica. Los autores señalan que esto es compatible con que se trate de EV y no de agregados proteicos ni de lipoproteínas.
Contar las «partículas luminosas» que salen al exterior
A continuación, los autores hicieron que fibroblastos de ratón NIH3T3 produjeran un SHH que brilla en verde (SHHN-EGFP) y filmaron directamente las partículas que se movían en el medio de cultivo. Partículas luminosas de aproximadamente 1 micrómetro de diámetro flotan en el líquido describiendo un movimiento browniano. Al añadir CID, su número aumentó de forma significativa.
Aquí los autores probaron si podían «frenarlo» con dos fármacos.
- Al inhibir Hsp90 con TAS-116 (0.5 micromolar, 48 horas), el aumento de liberación provocado por CID desapareció
- Al inhibir la esfingomielinasa neutra 2 (nSMase2) con GW4869 (1.25 micromolar), también desapareció
O sea, ambos son necesarios. Conviene añadir que TAS-116 se llama pimitespib y es un fármaco real, aprobado en Japón en junio de 2022 para tratar los tumores del estroma gastrointestinal (GIST) que han progresado tras la quimioterapia (nombre comercial Jeselhy). Aquí se usa como herramienta de investigación.
Y el golpe decisivo fueron los mutantes de Rab18.
- En células que expresaban Rab18S22N (el mutante que imita la forma GDP, es decir OFF), el SHH intracelular disminuyó y aumentaron las SHH-XLEV que salían al exterior
- Con Rab18Q67L (el mutante que imita la forma GTP, es decir ON), el SHH se quedó dentro de la célula y la liberación disminuyó notablemente
No solo desde los fármacos: desde los genes se obtuvo un resultado en el mismo sentido. También por citometría de flujo, en la condición tratada con CID, el sobrenadante de las células con SHH fluorescente contenía de 2 a 3 veces más partículas fluorescentes grandes que el de las células sin marcaje, lo que confirmó que SHH está realmente dentro de esas partículas grandes.
¿Por dónde salen? — Desde «la zona que rodea el núcleo»
A partir de aquí viene, creo, la parte más bonita del artículo.
Al filmar a lo largo del tiempo las células tratadas con CID, en menos de 30 minutos la señal de SHH se concentró alrededor del núcleo (la región perinuclear) y, en menos de 1 hora, se vieron estructuras que desde ahí se desplazaban verticalmente hacia la membrana plasmática.
Y al usar un microscopio de lámina de luz reticular (lattice light-sheet), un equipo capaz de tomar imágenes tridimensionales a gran velocidad sin dañar las células, se captó cómo las SHH-XLEV tubulares y vesiculares de 1–2 micrómetros se liberan únicamente desde la membrana plasmática que rodea al núcleo. Las partículas que salen permanecen un rato adheridas a la superficie celular y luego se sueltan de golpe.
👦 Estudiante: ¿De verdad importa por qué parte de la célula salen?
🧬 Exotaro: Importa muchísimo. Si lo comparamos con una fábrica, es la cuestión de por qué puerta del edificio se despachan los productos, y que la salida esté fijada significa que ahí hay una línea de carga dedicada. Y además, en el contexto del desarrollo, la dirección en que se envía decide la forma del cuerpo. Una secreción con dirección es, en sí misma, información.
¿Por qué se acumulan alrededor del núcleo? — El tira y afloja de los motores
Entonces, ¿por qué se arrima al núcleo la Rab18 en OFF? Dentro de la célula, dos tipos de motores circulan en sentidos opuestos sobre unos rieles llamados microtúbulos: las cinesinas hacia fuera (la periferia celular) y las dineínas hacia dentro (hacia el núcleo). Los resultados de los ensayos de unión in vitro (pull-down con GST) se repartieron con limpieza.
- Rab18-GTP (ON) se unió bien a la cinesina 1 (KIF5A)
- Rab18-GDP (OFF) se unió bien a Hsp90α y nSMase2
Es decir, al pasar a OFF se rompe el vínculo con el motor que va hacia fuera. Si uno de los dos bandos del tira y afloja suelta la cuerda, la vesícula queda arrastrada por la dineína, que va hacia dentro, y se acumula alrededor del núcleo: este es el modelo que proponen los autores. No han captado a la dineína tirando de hecho, así que esto es una inferencia.
De hecho, al aplicar fármacos que inhiben PI3K (ZSTK474, LY294002), las vesículas que portan Rab18 se dispersaron por toda la célula, mientras que al reforzar con SF1670 la señalización por debajo de PI3K se agruparon claramente alrededor del núcleo. La forma GDP, S22N, se arrimó a la región perinuclear de manera significativamente mayor que la forma GTP, Q67L. El lugar de esa agrupación son endosomas con el marcador AP-1 (la superposición fue significativamente más intensa que con AP-3): uno de los centros de clasificación del interior de la célula.
La ubicación de Hsp90α también la decide el estado de Rab18. En las células que expresaban la forma GDP, en 123 de 125 células Hsp90α se agrupó alrededor del núcleo, frente a 8 de 88 con la forma GTP. Además, el tratamiento con CID aumentó de forma significativa la ceramida intracelular (el lípido que fabrica nSMase2); ese aumento se anuló con GW4869 y se recuperó al añadir SF1670. La ceramida es conocida por curvar las membranas y favorecer la formación de bolsas.
Ya tenemos todas las piezas. Entra PI3K → Rab18 se acumula alrededor del núcleo en su forma OFF → allí se reclutan Hsp90α y nSMase2 → la membrana se remodela y se forma una bolsa grande → esta sale por la membrana plasmática que rodea al núcleo. Ese es el guion que han dibujado los autores.
Con un estímulo prolongado se forman «masas» fuera de la célula
Al mantener el CID durante 24–30 horas, aparecieron fuera de la célula grandes estructuras ricas en Hsp90α de 20–40 micrómetros de diámetro, y dentro de ellas había SHH-XLEV. A menudo quedaban conectadas con la superficie celular mediante finas prolongaciones semejantes a citonemas.
En cambio, en las células que expresaban la forma GTP de Rab18 el cuadro era distinto: sobre la superficie de vidrio situada bajo la colonia y a su alrededor se formaron grandes depósitos de SHH de unos 50–100 micrómetros de diámetro. Los autores lo interpretan como una estructura compatible con agregados de SHH unidos a la matriz extracelular. Es decir, según se esté en ON o en OFF, cambia la propia «manera de sacar» el SHH.
Además, al examinar las partículas SHH-positivas cercanas a la superficie celular, en el grupo de más de 2 micrómetros la señal de SHH en superficie era significativamente más intensa que en el grupo de 2 micrómetros o menos (en el pie de figura, n = 27 frente a 90, con la célula como unidad). Sugiere que, al liberarse, la superficie de la bolsa se está remodelando.
Y se formaron vasos sanguíneos
Por último, el experimento funcional. Sembraron células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) sobre Matrigel y contaron cuántos esbozos de vaso (tubos) se formaban.
Al añadir junto con ellas la fracción de EV recogida del sobrenadante de cultivo de MSC (unos 10 microgramos/mL en masa de proteína), esto es lo que ocurrió:
- Comparado con el control de DMSO, en los grupos SF1670 y CID se formaron alrededor de 4–5 veces más tubos (número de tubos por 0.72 milímetros cuadrados; n = 5, ANOVA de una vía)
Además, cuando se hizo que las propias HUVEC produjeran SHH, los tubos aumentaron de forma significativa respecto al control (por 1.62 milímetros cuadrados; n = 3–4). El texto principal dice «alrededor de 4 veces», pero al leer las medias en la figura el control queda en torno a 15 y el grupo SHH en torno a 45, lo que parece más bien un factor de 3. En cualquier caso, respalda que SHH tiene por sí mismo la capacidad de hacer que se formen vasos.
¿Cómo cambiará el futuro? (el camino hacia la clínica)
«Cuánto se puede obtener»: el muro real de las terapias con MSC
Cuando se intenta convertir en medicamento las EV derivadas de MSC, lo primero con lo que uno choca es el rendimiento. Aunque se cultiven células en gran cantidad, la cantidad de vesículas que se recoge es modesta. Por eso tiene mucho valor un fármaco capaz de ordenar «saca más» a la célula. El CID y el SF1670 de este artículo son precisamente candidatos a eso.
Y aquí volvemos a la patente que dejé en suspenso. La solicitud publicada (publicación internacional WO2023/219119; en Japón, la publicación de solicitud no examinada 2023-167506) se titula «Método para producir vesículas extracelulares que contienen una sustancia bioactiva». El solicitante es la Universidad de Tokio y los inventores son Tanaka y Wang. La reivindicación 1 dice: «un método para producir vesículas extracelulares, comprendiendo dicho método obtener las vesículas extracelulares secretadas por células sometidas a un tratamiento que inactiva Rab». Las reivindicaciones siguientes enumeran las células madre mesenquimales, tanto los inhibidores de Rab como los mutantes de Rab18 en forma GDP, las propias «vesículas extracelulares que contienen Shh de 800 nanómetros o más y/o con un volumen de 10⁹ nanómetros cúbicos o más», e incluso una composición farmacéutica que las tenga como principio activo.
Es decir, este artículo es a la vez un hallazgo académico y el respaldo de un método de producción ya solicitado en patente. Dado que está correctamente declarado como conflicto de interés, no hay en ello nada irregular, pero es un trasfondo que conviene conocer al leerlo. En el registro público de proyectos del autor figura también, como investigación traslacional de AMED entre 2022 y 2024, un proyecto titulado «Desarrollo de métodos para potenciar cualitativa y cuantitativamente la secreción de vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales humanas con vistas a la recuperación temprana tras un infarto de miocardio» (no he podido confirmar la correspondencia con los números de proyecto que indica el artículo). El objetivo es coherente.
Hay, eso sí, un punto que no permite alegrarse sin más. Lo que CID aumentó fueron las bolsas del lado grande y, al mismo tiempo, la secreción de EV pequeñas tendía más bien a quedar reprimida. Es decir, no es que «aumente todo», sino que «se intercambia». Según lo que se quiera convertir en medicamento, este fármaco puede ser aliado o enemigo.
Ya existe en Japón un fármaco que detiene Hsp90
El TAS-116 (pimitespib) que aquí se usó para inhibir Hsp90 está aprobado en Japón como tratamiento del GIST. En el contexto de este artículo, el uso va en sentido contrario: ¿qué ocurre con la secreción de este tipo de vesículas dentro del cuerpo de un paciente al que se le está inhibiendo Hsp90 para tratar un cáncer? Como pregunta tiene sentido, pero este artículo no lo ha investigado. Queda estrictamente como tarea futura.
¿Para qué puede servir una bolsa que transporta SHH?
SHH no solo hace que se formen vasos: es una molécula implicada de forma amplia en el desarrollo y en la reparación de tejidos. La idea misma de «cargar en una barquita de membrana una molécula que, al estar modificada con lípidos, no puede viajar sola, y entregarla así» me parece interesante desde el punto de vista de la liberación de fármacos.
Dicho esto, quiero insistir en que de aquí a la clínica la distancia es larga. Este artículo no contiene ningún experimento terapéutico en animales. Los ratones solo aparecen para obtener el extracto cerebral que se usa en los ensayos de unión in vitro. Lo de «se formaron vasos» ocurrió dentro de una placa de cultivo; no se formaron vasos dentro de un organismo vivo.
Cómo leer este estudio con ojo crítico (limitaciones y vías para elevar su calidad)
Primero, lo que se puede valorar
- La manera de filmar es seria. Movilizan disco giratorio, Airyscan e incluso microscopía de lámina de luz reticular, y muestran en imágenes reales el fenómeno de que «las bolsas grandes salen desde el contorno del núcleo». No se quedan en indicadores indirectos.
- Aprietan con las dos ruedas: fármacos y genética. Con solo el fármaco (CID) todo acabaría en «quizá sea un efecto secundario del fármaco», pero haber obtenido resultados opuestos con los mutantes GDP y GTP de Rab18 engrosa el apoyo de su afirmación.
- Declaran con claridad los límites de su propio diseño. Los propios autores escriben que su objetivo era «no insistir en la pureza, sino mostrar la existencia, el enriquecimiento y la secreción regulada de las SHH-XLEV». Es una actitud honesta.
- Declaran explícitamente haber manejado las EV conforme a MISEV2023, publican en CC BY y revelan la solicitud de patente.
Puntos que conviene leer con cuidado
Primero: la explicación del fármaco central contradice la fuente original de ese fármaco. El artículo describe repetidamente CID1067700 como «un inhibidor pan-Rab que aumenta la forma GDP de las Rab». Pero el artículo que caracterizó este compuesto por primera vez dice algo distinto. CID1067700 es un inhibidor competitivo que inhibe en más del 97% la unión tanto de BODIPY-GTP como de BODIPY-GDP, y tanto Rab7Q67L, que imita la forma GTP, como Rab7T22N, que imita la forma GDP, quedaron inhibidos por igual: es decir, lo natural es pensar que la proteína queda en un estado en el que el nucleótido se ha desprendido (Agola JO, et al. ACS Chem Biol 2012;7:1095-1108). El blanco era Rab7, se examinaron seis constructos proteicos —incluido un mutante de Rac1— correspondientes a cinco GTPasas (Cdc42, Rac1, Rab2, Rab7 y H-Ras), y también se escribe que tenía «al menos un 40% de actividad inhibidora frente a todas las GTPasas ensayadas». Tampoco es exclusivo de las Rab.
La discrepancia no es pequeña: el título mismo del artículo es «Rab18-GDP», y la mitad de su fundamento farmacológico se apoya en este fármaco. Lo que salva la situación es que existe de forma independiente una prueba genética (los fenotipos opuestos de S22N y Q67L). La conclusión en sí se sostiene por ese lado. Pero la explicación de que «es porque CID aumenta la forma GDP» no tiene, por ahora, respaldo.
Segundo: hay que tener cuidado con cómo se lee la figura que dice que «solo aumentaron las bolsas grandes». El eje vertical de la figura de NTA no es el número de partículas, sino su volumen (nm³/mL). Si el diámetro se multiplica por 20, el volumen se multiplica por 8000, de modo que una sola partícula grande supera sin esfuerzo a una multitud de partículas pequeñas en el eje del volumen. Y además la estadística es una prueba de chi cuadrado que cuenta tres veces si «se detectó o no se detectó» (3/3 frente a 0/3): no es una prueba de cuánto aumentó. El NTA, por otra parte, es un método que de entrada no destaca en la cuantificación por encima de 1 micrómetro. Como hay el respaldo de la microscopía electrónica, creo que podemos creer que aumentó, pero conviene tener presente la posibilidad de que la diferencia no sea tan espectacular como parece en la gráfica. Conviene añadir que este indicador de «volumen» coincide con que la patente mencionada antes define las vesículas con un criterio volumétrico de 10⁹ nanómetros cúbicos o más.
Tercero: en la interpretación de que se formaron vasos hay un gran salto lógico. El título habla de «SHH-XLEV que promueven la angiogénesis», pero lo que se aplicó a las células endoteliales fue la fracción de EV recogida del sobrenadante de cultivo de MSC, entera, y no hay ningún experimento en el que se aislaran y administraran solo las XLEV. Es decir, con los experimentos presentados no puede descartarse la contribución de componentes secretados distintos de las vesículas ni del fármaco residual (los propios autores declaran que la pureza no es su tema). Y además no hay ningún experimento que anule SHH: neutralizarlo con un anticuerpo, silenciarlo en las células donantes, inhibir Smoothened en las receptoras. Con cualquiera de los tres, la afirmación de que el efecto depende de SHH se habría reforzado mucho. El experimento en el que las propias HUVEC producen SHH demuestra que «SHH tiene capacidad de hacer que se formen vasos», pero no prueba que el efecto lo haya producido la bolsa transportándolo.
Cuarto: el momento en que observan la formación de tubos es temprano. Este artículo filma a los 90 minutos. Un protocolo muy utilizado indica que las células endoteliales no transformadas (las HUVEC lo son) forman tubos en 6 horas o menos (Arnaoutova I, Kleinman HK. Nat Protoc 2010;5:628-635), y otro procedimiento publicado señala que las células empiezan a alinearse en torno a 1 hora y los tubos con luz aparecen a partir de las 2 horas, y que lo deseable es contar en el punto de las 3–12 horas, cuando la formación de tubos alcanza su máximo (DeCicco-Skinner KL, et al. J Vis Exp 2014;(91):51312). Es cierto que los 90 minutos quedan por delante de ese intervalo, de modo que están observando un único punto, y además en pleno proceso de formación. Con una serie temporal que incluyera momentos posteriores y con indicadores como la longitud total de los tubos o el número de puntos de ramificación, la evaluación habría sido mucho más firme.
Quinto: no queda claro qué es exactamente lo que se detecta como «SHH». En la inmunotransferencia aparecen bandas en torno a 50 kDa y 27 kDa. Pero SHH es una molécula que sufre un corte proteolítico: la entidad que emite la señal es el fragmento N-terminal de unos 19 kDa, los 27 kDa corresponden al fragmento C-terminal y los 45–50 kDa al precursor sin cortar (Bumcrot DA, et al. Mol Cell Biol 1995;15:2294-2303). El peso molecular observado que indica el fabricante del anticuerpo empleado es también de 45–51 kDa. Si lo que va cargado en la bolsa es la entidad activa o el precursor —el punto que en realidad más importa para discutir la función— no se puede deducir.
Sexto: hay una incoherencia pequeña, pero indudable. En la gráfica de la figura 6C el número de células está impreso directamente y los totales son 112 y 169. Sin embargo, el pie de esa misma figura dice «n = 88–125 cells». Ese 88 y ese 125 coinciden exactamente con las cifras de la figura 5D. Probablemente sea una confusión al redactar el pie. No hace tambalear las conclusiones, pero los números deberían comprobarse.
Séptimo: hay dos lugares en los que la cita no sostiene la afirmación.
- La introducción cita el artículo de Mackie y colaboradores de 2012 afirmando que «se ha demostrado que cargar SHH en EV derivadas de MSC humanas aumenta el efecto terapéutico en un modelo de insuficiencia cardíaca isquémica». Pero lo que aquel artículo modificó no fueron MSC, sino células CD34-positivas humanas; el modelo era un infarto agudo de miocardio; y lo que se administró fueron células, no EV (el análisis de exosomas es in vitro). Que las células modificadas con SHH entreguen SHH a través de exosomas es cierto en sí mismo, pero el tipo celular y el nombre del modelo son distintos (Mackie AR, et al. Circ Res 2012;111:312-321).
- El Tanaka y colaboradores de 2024 que se cita como «haber descrito estructuras fibrosas asociadas a EV similares en el embrión» es, en la lista de referencias, el artículo sobre cinesina 1, canal de calcio y homeostasis de la glucemia (EMBO Rep), que no trata de EV, ni de estructuras fibrosas, ni de embriones. Dentro de la lista de referencias de los autores, lo que encaja por contenido es más bien el Developmental Cell de 2023 (el flujo del nódulo transporta una red fibrosa que contiene PKD1L1). No se puede afirmar con certeza cuál pretendían citar, pero cabe pensar que es muy probable que sea una confusión de número.
Octavo: los límites del propio diseño. Los mutantes de Rab18 se introdujeron por sobreexpresión, y no hay ningún experimento en el que se silenciara o eliminara la Rab18 endógena. Y los propios autores escriben que las células que expresaban S22N «tendían a ser más planas y a extenderse lateralmente (no lo hemos cuantificado)». Como un cambio de forma puede cambiar también la secreción, este es un factor de confusión que no se puede ignorar. Lo que usaron en los ensayos de unión fue además un extracto de cerebro de ratón, no material de las MSC ni de los fibroblastos que son el escenario del experimento. Y el término «XLEV» no es un término estándar de MISEV: el corte en 600 nanómetros es también una definición de los autores. Al comparar con otros estudios hay que tener esto en cuenta.
¿Qué habría hecho de esto un estudio de más calidad?
- Aislar y administrar solo las XLEV. Si mediante exclusión por tamaño, filtración o separación por fluorescencia se aplicaran por separado a las células endoteliales la fracción XLEV y la fracción de EV pequeñas igualando el número de partículas, la afirmación del título podría enunciarse tal cual a partir del experimento.
- Anular SHH. Vesículas procedentes de células donantes con SHH silenciado, vesículas neutralizadas con un anticuerpo anti-SHH, células endoteliales receptoras con Smoothened inhibido. Todo ello reforzaría enormemente la verificación de la dependencia de SHH (mejor aún si se lee la actividad transcripcional de Gli, por debajo). Pero para mostrar también «que fueron las XLEV las que lo transportaron» hay que combinarlo con la administración separada del punto anterior.
- Medir la formación de tubos a las 4–6 horas y con varios indicadores. Si además del número de tubos se tomaran la longitud total y el número de puntos de ramificación, el resultado sería también más resistente a la dispersión.
- Eliminar la propia Rab18. La jugada decisiva es comprobar si el fenotipo desaparece al reducir la Rab18 endógena con siRNA o con una deleción. Si además se midiera directamente el estado de unión a nucleótido de las Rab en células tratadas con CID, se podría reescribir correctamente la explicación del fármaco.
- Determinar la identidad de la carga. Establecer qué fragmento de SHH va a bordo mediante anticuerpos específicos de fragmento o espectrometría de masas.
- Comprobarlo en un organismo vivo. Si se observara en un modelo de tapón de Matrigel o de isquemia de las extremidades posteriores que los vasos aumentan, la expresión «promueve la angiogénesis» tendría respaldo in vivo.
Dicho esto, y en justicia, muchas de estas cosas quedan fuera del alcance de este artículo. Los autores declaran explícitamente que su objetivo es «mostrar la existencia y el mecanismo de regulación», y respecto a ese objetivo han hecho su trabajo. Lo problemático es más bien, creo, que el título y el resumen van un paso por delante del diseño del texto.
La visión de Exotaro
Permítanme empezar por una circunstancia personal. De las cuatro referencias que la introducción de este artículo cita como fundamento del potencial de las EV derivadas de MSC en medicina regenerativa, dos son artículos míos (Nakazaki, M., et al., Journal of Extracellular Vesicles 2021;10(11):e12137 y Nakazaki, M., et al., International Journal of Molecular Sciences 2024;25(24):13460). Y en los agradecimientos han tenido la amabilidad de mencionar mi propio nombre como interlocutor en las discusiones. Por eso este texto no es una crítica de un tercero completamente ajeno. Dicho eso, he procurado leerlo con la mayor imparcialidad posible.
Lo que yo he hecho hasta ahora tiene que ver con las bolsas del lado pequeño. En un modelo de lesión medular grave en roedores, las propias MSC administradas por vía intravenosa no llegan a la zona de la lesión y, sin embargo, las sEV que las MSC liberaban dentro del cuerpo sí migraban a la zona lesionada y se asociaban específicamente con los macrófagos M2 que allí había. Y con la misma cantidad total, una dosis única y masiva no funcionaba: solo cuando se entregaba repartida a lo largo de 3 días se conseguía una recuperación de la función motora equivalente a la de las propias células MSC. En ese proceso aumentaba la expresión de TGF-β, bajaba la permeabilidad de la barrera hematomedular y aumentaban las proteínas de las uniones estrechas.
Es decir, en el centro de mi trabajo también estaba estabilizar los vasos. El artículo de hoy dice que esa misma célula madre, usando bolsas de un tamaño completamente distinto, hace que se formen vasos. Defensa y ataque, estabilización y neoformación. Si la misma célula hace trabajos diferentes según el tamaño de bolsa que elige, eso es bastante interesante.
Hay algo que quiero escribir con honestidad, dirigido a mi propio campo. Nosotros tiramos a menudo las bolsas grandes. En los protocolos para trabajar con EV pequeñas es frecuente que, después de eliminar células y restos por centrifugación a baja velocidad, se pase la muestra por un filtro de 0.22 micrómetros antes de recoger las partículas pequeñas. Si se da ese paso de filtración, las bolsas de más de 600 nanómetros quedan fuera de lo que se recupera. (El artículo de hoy también detecta EV grandes después de clarificar por centrifugación a baja velocidad, así que si quedan eliminadas o no depende del procedimiento.)
Si es así, hay que preguntarse. ¿Cuánta de la actividad que en realidad pertenecía al lado descartado está incluida en lo que hemos venido midiendo como el efecto de las MSC-sEV? O, al contrario: si parte del efecto estaba precisamente en el lado descartado, ¿no hemos estado atribuyéndolo al mérito de las partículas pequeñas sin verlo? Este artículo no plantea esa pregunta directamente, pero fue lo primero que me vino a la cabeza al acabar de leerlo.
Otra cosa que me dejó una impresión fuerte es el enfoque de «por dónde salen». Tendemos a medir la secreción en términos de «salió o no salió», «mucho o poco», pero este artículo mostró en imágenes un fenómeno con dirección: que salen únicamente desde la membrana que rodea al núcleo. En el contexto del desarrollo, la dirección es en sí misma información. Si esto se aplica a la terapia, quizá la dirección en que las EV se liberan en la zona lesionada también influya realmente en el efecto.
Por último, sobre lo que he leído con ojo crítico. Las dos cosas a las que he dado más peso en este texto son que la explicación del mecanismo de acción del fármaco central contradice la fuente original y que no hay ningún experimento en el que se aislaran y administraran las XLEV propiamente dichas. Pero esto no significa en absoluto que el estudio carezca de valor. «Una bolsa grande sale, por una salida fija situada alrededor del núcleo, cargada con una molécula de señalización que lleva lípidos a cuestas»: haber filmado esa imagen es ya, de entrada, un logro. Lo que queda es comprobar con la bolsa misma si de verdad está formando vasos.
Un pequeño paquete que se encontró hace unos 20 años dentro de un embrión de ratón ha vuelto a una placa de cultivo de células madre humanas y está intentando formar vasos. Es un artículo que me hizo pensar con toda sinceridad: así es como transcurre el tiempo en la investigación básica.
※Este artículo ha sido redactado con la ayuda de IA.