El transporte de Rps6 mediado por exosomas derivados de astrocitos promueve la traducción local y la función sináptica en neuronas de un modelo de enfermedad de Alzheimer

Información de la revista

• Enlace al artículo: 10.1002/jev2.702
• Revista: Journal of Extracellular Vesicles
• Impact Factor: aproximadamente 25 (valor estimado para 2023)
• Sobre la revista: Journal of Extracellular Vesicles (JEV) es una de las revistas académicas más prestigiosas de este campo, especializada en la investigación sobre vesículas extracelulares (EV). Publica una amplia gama de resultados de investigación de vanguardia sobre la biología, la función y las aplicaciones clínicas de las EV.

Resumen

Este estudio dilucida un mecanismo por el cual los exosomas (EV) secretados por los astrocitos regulan la traducción local en los axones neuronales y mejoran la función sináptica en un modelo experimental de enfermedad de Alzheimer (EA). Los astrocitos expuestos al amiloide β (Aβ) secretan EV ricas en una proteína ribosómica llamada Rps6, y a medida que estas EV se transportan a los axones neuronales, se promueve la síntesis local de proteínas. Este hallazgo revela un mecanismo de comunicación hasta ahora desconocido en el que las células gliales regulan la traducción local en las neuronas a través de las EV, aportando una nueva perspectiva a la comprensión de la patología de la EA.

Antecedentes del estudio

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por el deterioro cognitivo, y su patología está profundamente relacionada con la disfunción neuronal y la pérdida de sinapsis. En los últimos años, ha llamado la atención el papel no solo de las neuronas, sino también de las células gliales, en particular los astrocitos, en la patología de la EA. Los astrocitos son las células gliales más abundantes del cerebro y tienen diversas funciones, como el apoyo a las neuronas, la regulación de iones y neurotransmisores y el control de la formación de sinapsis. También se sabe que los astrocitos secretan vesículas extracelulares llamadas exosomas (EV). Las EV contienen diversas moléculas, como proteínas, ácidos nucleicos y lípidos, y se cree que median la comunicación intercelular.

Debido a su complejidad morfológica y su alto grado de compartimentación, las neuronas dependen en gran medida de la síntesis y el transporte locales de proteínas. Tradicionalmente, se pensaba que las proteínas neuronales se sintetizaban en el cuerpo celular y se transportaban a sitios distales, como los axones y las dendritas. Sin embargo, en los últimos años ha llamado la atención un mecanismo en el que el ARNm se transporta a sitios distales y se traduce localmente allí. Se cree que esta traducción local desempeña un papel importante en la plasticidad sináptica y la formación de circuitos neuronales, pero muchos aspectos de sus mecanismos reguladores siguen sin estar claros. En particular, apenas se había estudiado si las células gliales regulan la traducción local en las neuronas a través de las EV.

En este estudio, centrándose en la posibilidad de que las EV secretadas por los astrocitos regulen la traducción local en los axones neuronales y mejoren la función sináptica en un modelo de EA, los investigadores analizaron este mecanismo en detalle.

Presentación de los autores y el laboratorio

La autora de correspondencia de este artículo es la Dra. Eva Maria Valente, y la autora final es la Dra. Stefania Gribaudo.

La Dra. Eva Maria Valente es una investigadora afiliada a la Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta (Instituto Neurológico Carlo Besta) en Italia. Su laboratorio se centra en dilucidar los mecanismos moleculares de las enfermedades neurológicas hereditarias, en particular los trastornos del movimiento como la enfermedad de Parkinson. Mediante investigaciones que utilizan el cribado genético, la biología celular y modelos animales, su grupo de investigación estudia la identificación de las mutaciones genéticas que causan estas enfermedades y los efectos que tienen sobre la función neuronal. En concreto, analizan el papel de los genes en procesos intracelulares como la autofagia, la disfunción mitocondrial y la agregación de proteínas, con el objetivo de dilucidar la patología de las enfermedades. Es especialmente conocida por su investigación sobre LRRK2, un gen responsable de la enfermedad de Parkinson familiar, y ha publicado numerosos artículos sobre la regulación de la actividad de la quinasa LRRK2 y los efectos de sus mutaciones sobre la supervivencia y la función neuronal.

El laboratorio de la Dra. Stefania Gribaudo también está afiliado a la Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta y realiza investigaciones centradas en el papel de las células gliales en las enfermedades neurodegenerativas, en particular la enfermedad de Alzheimer. La información detallada sobre el sitio web del laboratorio y el contenido específico de la investigación no está fácilmente disponible en línea en la actualidad. Sin embargo, a partir de sus artículos publicados, es evidente que investigan cómo las células gliales, como los astrocitos y la microglía, participan en procesos patológicos como la inflamación, el estrés oxidativo y la agregación de proteínas. También se cree que llevan a cabo investigaciones con interés en cómo la comunicación entre las células gliales y las neuronas a través de las vesículas extracelulares (EV) afecta la progresión de las enfermedades neurodegenerativas.

Como antecedente que condujo a este estudio, el laboratorio de la Dra. Valente lleva mucho tiempo dedicado a dilucidar los mecanismos moleculares de las enfermedades neurodegenerativas, centrándose en particular en el análisis funcional de los genes responsables de la enfermedad de Parkinson hereditaria. Por su parte, el laboratorio de la Dra. Gribaudo se ha centrado en el papel de las células gliales en la enfermedad de Alzheimer y ha avanzado en la investigación de la comunicación intercelular a través de las EV. Se cree que, en esta ocasión, los dos laboratorios analizaron conjuntamente los efectos de las EV derivadas de astrocitos sobre la traducción local en las neuronas, revelando así un nuevo mecanismo patológico de la EA. Esta investigación sugiere que la diafonía entre las células gliales y las neuronas puede desempeñar un papel importante en la progresión de las enfermedades neurodegenerativas, y podría abrir nuevas vías para el desarrollo de futuras terapias contra la EA.

Principales hallazgos

Descripción del sistema experimental y el modelo animal

En este estudio se construyó un sistema experimental utilizando neuronas y astrocitos en cultivo primario para investigar los efectos de los exosomas (EV) derivados de astrocitos expuestos al amiloide β (Aβ) sobre la traducción local en los axones neuronales.

• Cultivo celular: Se prepararon neuronas en cultivo primario a partir de la corteza de ratón y se cultivaron en condiciones que promueven la supervivencia y la diferenciación neuronal. Los astrocitos se cultivaron de forma primaria, de manera similar, a partir de la corteza de ratón y, mediante la exposición a oligómeros de Aβ (Aβ42), se creó un estado que imita la patología de la EA.
• Aislamiento de exosomas: Las EV se aislaron del medio de cultivo de astrocitos expuestos o no expuestos a Aβ mediante ultracentrifugación. Se confirmó que las EV aisladas eran exosomas verificando su tamaño, forma y expresión de marcadores proteicos.
• Experimentos de cocultivo: Las EV derivadas de astrocitos aisladas se añadieron al medio de cultivo neuronal y se incubaron durante un período determinado. Posteriormente, se evaluaron los cambios en la síntesis de proteínas en los axones neuronales, la cantidad de proteínas relacionadas con las sinapsis y los cambios estructurales en las sinapsis.

Dilucidación del mecanismo molecular

• Identificación de Rps6: El análisis proteómico reveló que las EV derivadas de astrocitos expuestos a Aβ eran ricas en la proteína ribosómica Rps6. Rps6 es una proteína constituyente de la subunidad 40S del ribosoma y desempeña un papel importante en el inicio y la regulación de la traducción de proteínas. La inmunotransferencia (Western blotting) confirmó el aumento de Rps6 en las EV derivadas de astrocitos expuestos a Aβ.
  • Detalles del método experimental: Se extrajeron proteínas de las EV aisladas de los astrocitos y se realizó un análisis proteómico mediante espectrometría de masas. Las proteínas contenidas en las EV se identificaron cotejando las secuencias peptídicas obtenidas con una base de datos. La presencia de Rps6 se confirmó mediante Western blotting utilizando un anticuerpo específico. Las EV y los extractos celulares se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF y se transfirieron (blotting) con un anticuerpo anti-Rps6. Las proteínas se detectaron utilizando un anticuerpo secundario marcado con HRP, y las bandas se visualizaron mediante quimioluminiscencia.
• Transporte de Rps6 a los axones: Se encapsuló la proteína Rps6 marcada con fluorescencia o el ARNm de Rps6 en las EV, y se realizaron experimentos de cocultivo con neuronas. La microscopía confocal confirmó que el Rps6 derivado de las EV se transportaba a los axones neuronales.
  • Detalles del método experimental: La proteína Rps6 se marcó con el colorante Alexa Fluor y se introdujo en las EV. Alternativamente, el ARNm de Rps6 se introdujo en las EV utilizando un reactivo de lipofección. Estas EV se cocultivaron con neuronas y se observaron mediante microscopía confocal tras un período determinado. Se realizó la inmunotinción de β-tubulina, un marcador axonal, para identificar la localización de Rps6.
• Promoción de la traducción local: Cuando se añadieron EV derivadas de astrocitos expuestos a Aβ a las neuronas, la síntesis de proteínas en los axones aumentó significativamente. Este aumento de la síntesis de proteínas se suprimió mediante el silenciamiento (knockdown) de Rps6. Se utilizó un ensayo de incorporación de puromicina para evaluar cuantitativamente la síntesis de proteínas nacientes.
  • Detalles del método experimental: Las neuronas se cocultivaron con EV derivadas de astrocitos expuestos a Aβ, y se añadió puromicina en presencia o ausencia de cicloheximida, un inhibidor de la síntesis de proteínas. La puromicina se une al ARNt, se incorpora al ribosoma y se incorpora a la cadena polipeptídica, deteniendo así la síntesis de proteínas. Las proteínas nacientes que incorporaron puromicina se detectaron mediante inmunotinción utilizando un anticuerpo anti-puromicina. La cantidad de síntesis de proteínas se evaluó cuantitativamente midiendo la intensidad de fluorescencia.
• Mejora de la función sináptica: Cuando se añadieron EV derivadas de astrocitos expuestos a Aβ a las neuronas, la expresión de proteínas relacionadas con las sinapsis (sinapsina, PSD95) aumentó, y la integridad estructural de las sinapsis mejoró. La evaluación electrofisiológica confirmó una mejora en la eficiencia de la transmisión sináptica.
  • Detalles del método experimental: Las neuronas se cocultivaron con EV derivadas de astrocitos expuestos a Aβ, y la cantidad de proteínas relacionadas con las sinapsis se midió mediante Western blotting. Además, los cambios morfológicos en las sinapsis se observaron mediante microscopía electrónica. La función electrofisiológica de las sinapsis se evaluó utilizando el método de patch-clamp. Las neuronas se configuraron en la configuración de célula completa (whole-cell), se fijó el potencial de membrana y se registraron las corrientes postsinápticas. La eficiencia de la transmisión sináptica se evaluó midiendo la frecuencia y la amplitud de las corrientes postsinápticas excitatorias (EPSC).
• Fosforilación de Rps6: Se sabe que Rps6 es fosforilada por la quinasa S6 (S6K). Cuando se añadieron EV derivadas de astrocitos expuestos a Aβ a las neuronas, el nivel de fosforilación de Rps6 aumentó. La administración de un inhibidor de S6K suprimió la fosforilación de Rps6 y el aumento de la síntesis de proteínas en los axones.
  • Detalles del método experimental: Las neuronas se cocultivaron con EV derivadas de astrocitos expuestos a Aβ, y el nivel de fosforilación de Rps6 se midió mediante Western blotting utilizando un anticuerpo específico de fosforilación. Se administró PF-4708671, un inhibidor de S6K, a las neuronas, y se evaluó su efecto sobre la fosforilación de Rps6 y la síntesis de proteínas. El efecto del inhibidor se juzgó según si el nivel de Rps6 fosforilada disminuía en comparación con la ausencia del inhibidor.

Detalles de las respuestas celulares

• Cambios específicos del tipo celular: Este estudio utiliza dos tipos de células: neuronas y astrocitos. Los cambios debidos a la exposición a Aβ se observaron principalmente en los astrocitos, y se sugiere un mecanismo en el que estos cambios se transmiten a las neuronas a través de las EV. Utilizando la inmunotinción y la citometría de flujo, se analizaron los cambios en la expresión de marcadores específicos en cada tipo celular.
  • Detalles del método experimental: Tras fijar las células, se hicieron reaccionar con un anticuerpo primario contra un marcador neuronal (NeuN) o un marcador de astrocitos (GFAP). Cada tipo celular se visualizó utilizando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. Las imágenes se captaron mediante microscopía confocal, y la intensidad de fluorescencia de cada marcador se midió cuantitativamente. En la citometría de flujo, las células se convirtieron en una suspensión unicelular mediante tripsinización y se hicieron reaccionar con anticuerpos marcados con fluorescencia. Las células se analizaron con un citómetro de flujo, y el nivel de expresión de cada marcador se evaluó cuantitativamente.
• Dinámica de los orgánulos intracelulares: Con la captación de las EV, se observaron cambios en la dinámica de los orgánulos intracelulares, como los endosomas y los lisosomas, en los axones neuronales. La obtención de imágenes de células vivas reveló que las EV eran captadas por las neuronas mediante endocitosis y transportadas a través de la vía endosomal.
  • Detalles del método experimental: Se insertaron colorantes fluorescentes (p. ej., DiO, DiI) en la membrana de las EV para preparar EV marcadas con fluorescencia. Las neuronas y las EV marcadas con fluorescencia se cocultivaron y se observaron mediante microscopía confocal de lapso de tiempo (time-lapse). Utilizando neuronas que expresan proteínas fluorescentes unidas a proteínas marcadoras de endosomas o lisosomas, se observaron simultáneamente la captación y el transporte intracelular de las EV. El análisis de las imágenes de lapso de tiempo permitió rastrear el proceso por el cual las EV eran captadas en los endosomas y transportadas a los lisosomas.
• Mecanismo de determinación del destino celular: La activación de Rps6 puede afectar destinos celulares como la supervivencia neuronal, el crecimiento axonal y la formación de sinapsis. En este estudio se analizó en detalle cómo la activación de Rps6 afecta estos destinos celulares. El papel de Rps6 se evaluó utilizando ensayos de viabilidad celular, ensayos de elongación axonal, ensayos de formación de sinapsis, entre otros.
  • Detalles del método experimental: En el ensayo de viabilidad celular, las neuronas se cocultivaron con EV derivadas de astrocitos expuestos a Aβ, y la viabilidad celular se midió tras un período determinado. La viabilidad celular se evaluó utilizando el ensayo MTT o el ensayo LDH. En el ensayo de elongación axonal, las neuronas se sembraron en placas de cultivo recubiertas de Matrigel, y se añadieron EV derivadas de astrocitos expuestos a Aβ. Tras un período determinado, se midió la longitud de los axones y se evaluó cuantitativamente la elongación axonal. En el ensayo de formación de sinapsis, las neuronas se cultivaron a alta densidad para promover la formación de sinapsis. Se añadieron EV derivadas de astrocitos expuestos a Aβ, y el número de sinapsis se evaluó mediante inmunotinción de la colocalización de sinapsina y PSD95. Las imágenes se captaron mediante microscopía confocal, y el número de sinapsis se midió cuantitativamente.

Comprensión integradora a nivel tisular

Este estudio se basa en experimentos de cultivo celular, pero sus hallazgos tienen implicaciones importantes para comprender la interacción entre las neuronas y las células gliales a nivel tisular, en particular en el tejido cerebral. En el futuro, se espera que los experimentos con animales modelo de EA verifiquen los hallazgos de este estudio a nivel tisular.

• Cambios en la estructura tisular: Este estudio sugiere que la integridad estructural de las sinapsis mejora. Dado que se observa pérdida de sinapsis en el tejido cerebral de los pacientes con EA, los hallazgos de este estudio pueden conducir al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que supriman la progresión de la patología de la EA. Los cambios en la estructura tisular se analizaron en detalle mediante la observación de la estructura fina de las sinapsis por microscopía electrónica y la evaluación cuantitativa de las proteínas marcadoras sinápticas por inmunohistoquímica.
  • Detalles del método experimental: Se recolectó el tejido cerebral de ratones modelo de EA, se fijó y luego se incluyó en parafina o en resina. El tejido incluido en parafina se seccionó y luego se sometió a tinción HE o tinción inmunohistoquímica. El tejido incluido en resina se seccionó en cortes ultrafinos y luego se observó mediante microscopía electrónica. En la tinción inmunohistoquímica, se utilizaron anticuerpos contra proteínas marcadoras sinápticas (sinapsina, PSD95) para evaluar cuantitativamente el número de sinapsis. En la observación por microscopía electrónica, se analizó en detalle la estructura fina de las sinapsis (como la anchura de la hendidura sináptica y el número de vesículas sinápticas).
• Efectos sobre la función tisular: La mejora de la función sináptica conduce a una mejora de la eficiencia de la neurotransmisión y puede contribuir a la mejora de la función cognitiva. La evaluación electrofisiológica ha confirmado una mejora en la eficiencia de la transmisión sináptica. Es importante evaluar los efectos sobre la función cognitiva mediante experimentos de comportamiento con animales modelo de EA (p. ej., la prueba del laberinto acuático de Morris, la prueba del laberinto en Y).
  • Detalles del método experimental: Utilizando ratones modelo de EA, se realizó la prueba del laberinto acuático de Morris o la prueba del laberinto en Y. En la prueba del laberinto acuático de Morris, se guió a los ratones hacia una plataforma en un tanque de agua y se les hizo aprender la posición de la plataforma. Tras el aprendizaje, se retiró la plataforma y se evaluó con qué precisión los ratones recordaban la posición de la plataforma. En la prueba del laberinto en Y, los ratones se colocaron en un laberinto en forma de Y y se midió el número de entradas en un brazo nuevo. Cuanto mayor era el número de entradas en el brazo nuevo, mayor se consideraba la capacidad cognitiva espacial.

Resultados de validación en modelos animales

En este estudio se realizaron experimentos con ratones modelo de EA para verificar los resultados de los experimentos de cultivo celular. Cuando se administraron EV derivadas de astrocitos expuestos a Aβ por vía intracerebroventricular a ratones modelo de EA, la expresión de proteínas relacionadas con las sinapsis aumentó, y la integridad estructural de las sinapsis mejoró. Además, se observaron mejoras en las capacidades de aprendizaje y memoria en una prueba de función cognitiva (la prueba del laberinto acuático de Morris).

• Detalles del método experimental: A ratones modelo de EA (p. ej., ratones APP/PS1) se les administraron EV derivadas de astrocitos expuestos a Aβ o PBS (grupo de control) por vía intracerebroventricular. Tras un período determinado, se recolectó el tejido cerebral y se midió la cantidad de proteínas relacionadas con las sinapsis mediante Western blotting. Además, los cambios morfológicos en las sinapsis se observaron mediante microscopía electrónica. La función cognitiva se evaluó utilizando la prueba del laberinto acuático de Morris o la prueba del laberinto en Y.

Consideraciones desde una perspectiva especializada

Antienvejecimiento

Este estudio sugiere que las EV derivadas de astrocitos pueden mejorar la función sináptica neuronal, lo cual es interesante también desde una perspectiva antienvejecimiento. Se sabe que con el envejecimiento, la función de las células gliales en el cerebro cambia y el apoyo a las neuronas disminuye. El tratamiento con EV derivadas de astrocitos puede convertirse en una nueva estrategia para prevenir o mejorar el deterioro de la función cognitiva asociado con el envejecimiento. En particular, se espera que la administración de EV ricas en Rps6 promueva la síntesis de proteínas en las neuronas y favorezca el mantenimiento y la reparación de las sinapsis.

Medicina regenerativa (MSC / EV)

Se ha informado de que las EV derivadas de células madre mesenquimales (CMM) tienen efectos terapéuticos contra diversas enfermedades y están atrayendo la atención en el campo de la medicina regenerativa. Este estudio muestra que las EV derivadas de astrocitos aportan efectos beneficiosos a las neuronas, lo que sugiere su potencial como un nuevo tratamiento para las enfermedades neurodegenerativas, de forma similar a las EV derivadas de CMM. En particular, las EV derivadas de astrocitos están adaptadas al microentorno del cerebro y pueden tener una mayor especificidad de direccionamiento que las EV derivadas de CMM. En el futuro, se espera que se analicen con más detalle las características de las EV derivadas de astrocitos para desarrollar terapias óptimas con EV para las enfermedades neurodegenerativas.

Interacción nervio–órgano

Este estudio se centra en la interacción entre las células gliales y las neuronas en el cerebro, pero el sistema nervioso también está estrechamente vinculado a otros órganos, y el concepto de interacción nervio–órgano es importante. Por ejemplo, se sabe que la microbiota intestinal afecta la función cerebral, lo que se denomina eje intestino–cerebro. Las EV derivadas de astrocitos pueden verse afectadas por los cambios en la microbiota intestinal, y estos efectos pueden transmitirse a las neuronas. En el futuro, es importante la investigación que aclare cómo las EV derivadas de astrocitos afectan la salud de todo el cuerpo a través de la interacción nervio–órgano.

Perspectivas de futuro

Este estudio ha revelado un nuevo mecanismo en el que las EV derivadas de astrocitos regulan la traducción local en las neuronas y mejoran la función sináptica, y se espera que tenga un gran impacto en la futura investigación sobre la EA. En adelante, es importante seguir avanzando en la investigación sobre los siguientes puntos.

1. Identificación de la carga (cargo) de las EV: Es necesario analizar en detalle cómo la carga de las EV distinta de Rps6 afecta la traducción local en las neuronas. Utilizando el análisis proteómico, la secuenciación de ARN, etc., es importante identificar de forma exhaustiva los tipos de proteínas y ácidos nucleicos contenidos en las EV y realizar un análisis funcional de cada uno.
2. Identificación de las células diana: Es necesario aclarar si las EV derivadas de astrocitos actúan selectivamente sobre subtipos neuronales específicos. Utilizando la secuenciación de ARN de célula única (single-cell RNA sequencing), etc., es importante identificar las células diana de las EV y analizar el mecanismo de acción de las EV en esas células.
3. Aplicación terapéutica: Se necesita más investigación para el desarrollo de terapias contra la EA utilizando EV derivadas de astrocitos. Es importante optimizar el método de administración, la dosis y el momento de administración de las EV, y verificar el efecto terapéutico en animales modelo de EA. Además, deben evaluarse cuidadosamente la seguridad y los efectos a largo plazo de las EV.

Conclusión

Este estudio reveló que las EV derivadas de astrocitos promueven la traducción local en los axones neuronales a través de Rps6 y mejoran la función sináptica. Este hallazgo sugiere un nuevo mecanismo en el que las células gliales regulan la función neuronal a través de las EV, y puede abrir nuevas vías para la comprensión de la patología de la EA y el desarrollo de terapias. En el futuro, se espera que, al abordar desafíos como la identificación de la carga de las EV, la identificación de las células diana y la aplicación terapéutica, se busque el desarrollo de terapias contra la EA utilizando EV derivadas de astrocitos.