星形胶质细胞来源的外泌体介导的Rps6转运促进阿尔茨海默病模型神经元的局部翻译与突触功能

期刊信息

• 论文链接：10.1002/jev2.702
• 期刊：Journal of Extracellular Vesicles
• Impact Factor：约25（2023年估算值）
• 期刊简介：Journal of Extracellular Vesicles（JEV）是专门研究细胞外囊泡 (EV) 的、该领域最具权威性的学术期刊之一。它广泛刊载有关EV的生物学、功能及临床应用的最前沿研究成果。

概要

本研究阐明了在阿尔茨海默病（AD）实验模型中，星形胶质细胞分泌的外泌体（EV）调控神经元轴突局部翻译并改善突触功能的机制。暴露于淀粉样蛋白β（Aβ）的星形胶质细胞分泌富含一种名为Rps6的核糖体蛋白的EV，随着这些EV被转运至神经元轴突，局部蛋白质合成得以促进。这一发现揭示了一种此前未知的全新通讯机制，即胶质细胞通过EV调控神经元的局部翻译，为理解AD的病理带来了新的视角。

研究背景

阿尔茨海默病（AD）是一种以认知功能下降为特征的神经退行性疾病，其病理与神经元功能障碍和突触丧失密切相关。近年来，在AD的病理中，不仅是神经元，胶质细胞、尤其是星形胶质细胞的作用也备受关注。星形胶质细胞是脑内最丰富的胶质细胞，具有支持神经元、调节离子和神经递质、控制突触形成等多种功能。此外，已知星形胶质细胞会分泌一种称为外泌体（EV）的细胞外囊泡。EV含有蛋白质、核酸、脂质等多种分子，被认为承担着细胞间通讯的功能。

由于其形态学的复杂性和高度的区室化，神经元高度依赖于蛋白质的局部合成与转运。以往认为，神经元的蛋白质在胞体中合成，并被转运至轴突和树突等远端部位；但近年来，mRNA被转运至远端部位并在那里进行局部翻译这一机制备受关注。这种局部翻译被认为在突触可塑性和神经回路形成中发挥着重要作用，但关于其调控机制仍有许多不明之处。特别是，胶质细胞是否通过EV调控神经元的局部翻译，几乎未曾被研究。

本研究着眼于在AD模型中，星形胶质细胞分泌的EV调控神经元轴突局部翻译并改善突触功能的可能性，对该机制进行了详细解析。

作者及实验室介绍

本论文的通讯作者是Dr. Eva Maria Valente，末位作者是Dr. Stefania Gribaudo。

Dr. Eva Maria Valente是隶属于意大利Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta（卡洛·贝斯塔神经病学研究所）的研究人员。她的实验室致力于阐明遗传性神经疾病、尤其是帕金森病等运动障碍的分子机制。她的研究小组通过运用基因筛查、细胞生物学和动物模型的研究，调查导致这些疾病的基因突变的鉴定及其对神经元功能的影响。具体而言，他们解析基因在自噬、线粒体功能障碍、蛋白质聚集等细胞内过程中的作用，旨在阐明疾病的病理。她尤其因对家族性帕金森病致病基因LRRK2的研究而闻名，并就LRRK2激酶的活性调节及其突变对神经元生存和功能的影响发表了多篇论文。

Dr. Stefania Gribaudo的实验室同样隶属于Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta，开展聚焦于胶质细胞在神经退行性疾病、尤其是阿尔茨海默病中作用的研究。关于该实验室的网站及具体研究内容的详细信息，目前尚难以在网上轻易查证。然而，从她们发表的论文可以看出，她们正在调查星形胶质细胞和小胶质细胞等胶质细胞如何参与炎症、氧化应激、蛋白质聚集等病理过程。此外，可以认为她们对细胞外囊泡（EV）介导的胶质细胞与神经元之间的通讯如何影响神经退行性疾病的进展也抱有兴趣并推进研究。

作为通向本研究的背景，Dr. Valente的实验室长年致力于阐明神经退行性疾病的分子机制，尤其专注于遗传性帕金森病致病基因的功能解析。另一方面，Dr. Gribaudo的实验室着眼于胶质细胞在阿尔茨海默病中的作用，推进了EV介导的细胞间通讯研究。可以认为，此次两个实验室共同解析了星形胶质细胞来源的EV对神经元局部翻译的影响，从而揭示了AD新的病理机制。这项研究提示，胶质细胞与神经元之间的串扰（crosstalk）可能在神经退行性疾病的进展中发挥重要作用，并有可能为今后AD治疗方法的开发开辟新的途径。

主要发现

实验体系与动物模型概述

本研究使用原代培养的神经元和星形胶质细胞，构建了用于调查暴露于淀粉样蛋白β（Aβ）的星形胶质细胞来源外泌体（EV）对神经元轴突局部翻译影响的实验体系。

• 细胞培养：从小鼠皮质制备原代培养神经元，并在促进神经元生存和分化的条件下进行培养。星形胶质细胞同样从小鼠皮质进行原代培养，并通过暴露于Aβ寡聚体（Aβ42），制造出模拟AD病理的状态。
• 外泌体分离：使用超速离心法，从暴露或未暴露于Aβ的星形胶质细胞培养液中分离出EV。通过确认所分离EV的大小、形状及蛋白质标志物的表达，确认其为外泌体。
• 共培养实验：将分离出的星形胶质细胞来源EV加入神经元培养液中，孵育一定时间。随后，评估神经元轴突中蛋白质合成的变化、突触相关蛋白的量以及突触的结构性变化等。

分子机制的阐明

• Rps6的鉴定：通过蛋白质组学分析发现，暴露于Aβ的星形胶质细胞来源EV中富含核糖体蛋白Rps6。Rps6是核糖体40S亚基的构成蛋白，在蛋白质翻译的起始和调节中发挥重要作用。Western blotting证实了暴露于Aβ的星形胶质细胞来源EV中Rps6的增加。
  • 实验方法详情：从星形胶质细胞分离出的EV中提取蛋白质，通过质谱进行蛋白质组学分析。通过将所获得的肽段序列与数据库进行比对，鉴定EV中所含的蛋白质。Rps6的存在通过使用特异性抗体的Western blotting得以确认。将EV及细胞提取物用SDS-PAGE分离，转印至PVDF膜后，用抗Rps6抗体进行印迹。使用HRP标记的二抗检测蛋白质，并通过化学发光法使条带可视化。
• Rps6向轴突的转运：将荧光标记的Rps6蛋白或Rps6 mRNA包封于EV中，进行了与神经元的共培养实验。通过共聚焦显微镜观察，证实了EV来源的Rps6被转运至神经元轴突。
  • 实验方法详情：用Alexa Fluor染料标记Rps6蛋白，并导入EV中。或者，使用脂质转染试剂将Rps6 mRNA导入EV中。将这些EV与神经元共培养，一定时间后用共聚焦显微镜观察。进行轴突标志物β-tubulin的免疫染色，以确定Rps6的定位。
• 局部翻译的促进：向神经元加入暴露于Aβ的星形胶质细胞来源EV后，轴突中的蛋白质合成显著增加。这种蛋白质合成的增加因Rps6的敲低（knockdown）而受到抑制。使用嘌呤霉素掺入实验，对新生蛋白质的合成进行了定量评估。
  • 实验方法详情：将神经元与暴露于Aβ的星形胶质细胞来源EV共培养，在蛋白质合成抑制剂放线菌酮（环己酰亚胺）存在或不存在的情况下加入嘌呤霉素。嘌呤霉素与tRNA结合，被掺入核糖体并整合进多肽链中，从而停止蛋白质合成。掺入嘌呤霉素的新生蛋白质通过使用抗嘌呤霉素抗体的免疫染色被检测。通过测定荧光强度，对蛋白质合成的量进行定量评估。
• 突触功能的改善：向神经元加入暴露于Aβ的星形胶质细胞来源EV后，突触相关蛋白（synapsin、PSD95）的表达增加，突触的结构完整性得以改善。通过电生理学评估，证实了突触传递效率的提高。
  • 实验方法详情：将神经元与暴露于Aβ的星形胶质细胞来源EV共培养，用Western blotting测定突触相关蛋白的量。此外，用电子显微镜观察突触的形态学变化。突触的电生理学功能使用膜片钳（patch-clamp）法进行评估。将神经元置于全细胞（whole-cell）构型，固定膜电位，记录突触后电流。通过测定兴奋性突触后电流（EPSC）的频率和振幅，评估突触传递效率。
• Rps6的磷酸化：已知Rps6会被S6激酶（S6K）磷酸化。向神经元加入暴露于Aβ的星形胶质细胞来源EV后，Rps6的磷酸化水平增加。通过给予S6K抑制剂，Rps6的磷酸化和轴突中蛋白质合成的增加受到抑制。
  • 实验方法详情：将神经元与暴露于Aβ的星形胶质细胞来源EV共培养，使用磷酸化特异性抗体通过Western blotting测定Rps6的磷酸化水平。向神经元给予S6K抑制剂PF-4708671，评估其对Rps6磷酸化和蛋白质合成的影响。抑制剂的效果通过与不存在抑制剂时相比、磷酸化Rps6的水平是否下降来判断。

细胞应答的详情

• 细胞类型特异性变化：本研究使用了神经元和星形胶质细胞这两种细胞类型。由Aβ暴露引起的变化主要在星形胶质细胞中被观察到，并提示了这些变化经由EV传递至神经元的机制。使用免疫染色和流式细胞术，解析了各细胞类型中特定标志物表达的变化。
  • 实验方法详情：将细胞固定后，使其与针对神经元标志物（NeuN）或星形胶质细胞标志物（GFAP）的一抗反应。使用荧光标记的二抗使各细胞类型可视化。用共聚焦显微镜拍摄图像，对各标志物的荧光强度进行定量测定。在流式细胞术中，将细胞经胰蛋白酶处理制成单细胞悬液，并使其与荧光标记的抗体反应。用流式细胞仪分析细胞，对各标志物的表达水平进行定量评估。
• 细胞内细胞器的动态：随着EV的摄取，神经元轴突中内体（endosome）、溶酶体等细胞内细胞器的动态出现了变化。通过活细胞成像，观察到EV经由内吞作用被摄入神经元，并经内体途径进行转运的情形。
  • 实验方法详情：在EV膜中插入荧光染料（例如：DiO、DiI），制备荧光标记的EV。将神经元与荧光标记的EV共培养，用延时（time-lapse）共聚焦显微镜观察。使用表达与内体或溶酶体标志蛋白结合的荧光蛋白的神经元，同时观察EV的摄取与细胞内转运的情形。通过对延时图像的解析，追踪EV被摄入内体并转运至溶酶体的过程。
• 细胞命运决定的机制：Rps6的激活可能影响神经元生存、轴突生长、突触形成等细胞命运。本研究详细解析了Rps6的激活如何影响这些细胞命运。使用细胞存活率实验、轴突伸长实验、突触形成实验等，评估了Rps6的作用。
  • 实验方法详情：在细胞存活率实验中，将神经元与暴露于Aβ的星形胶质细胞来源EV共培养，一定时间后测定细胞存活率。细胞存活率使用MTT实验或LDH实验进行评估。在轴突伸长实验中，将神经元接种于Matrigel包被的培养皿上，加入暴露于Aβ的星形胶质细胞来源EV。一定时间后，测定轴突的长度，对轴突伸长进行定量评估。在突触形成实验中，将神经元高密度培养，以促进突触形成。加入暴露于Aβ的星形胶质细胞来源EV，通过免疫染色评估synapsin与PSD95的共定位来评估突触的数量。用共聚焦显微镜拍摄图像，对突触的数量进行定量测定。

组织层面的整合性理解

本研究虽基于细胞培养实验，但其发现在理解组织层面、尤其是脑组织中神经元与胶质细胞的相互作用方面具有重要意义。未来，期待通过使用AD模型动物的实验，在组织层面验证本研究的发现。

• 组织结构的变化：本研究提示，突触的结构完整性得以改善。由于在AD患者的脑组织中可观察到突触的丧失，因此本研究的发现有可能促成抑制AD病理进展的新治疗策略的开发。通过电子显微镜观察突触的微细结构，以及免疫组织化学对突触标志蛋白的定量评估，详细解析了组织结构的变化。
  • 实验方法详情：采集AD模型小鼠的脑组织，固定后进行石蜡包埋或树脂包埋。石蜡包埋组织切片后，进行HE染色或免疫组织化学染色。树脂包埋组织超薄切片后，进行电子显微镜观察。在免疫组织化学染色中，使用针对突触标志蛋白（synapsin、PSD95）的抗体，对突触的数量进行定量评估。在电子显微镜观察中，详细解析突触的微细结构（突触间隙的宽度、突触小泡的数量等）。
• 对组织功能的影响：突触功能的改善会带来神经传递效率的提高，并有可能有助于认知功能的改善。通过电生理学评估，已证实突触传递效率的提高。重要的是，通过使用AD模型动物的行为实验（例如：Morris水迷宫试验、Y迷宫试验），评估对认知功能的影响。
  • 实验方法详情：使用AD模型小鼠，进行了Morris水迷宫试验或Y迷宫试验。在Morris水迷宫试验中，将小鼠引导至水槽内的平台，使其学习平台的位置。学习后，移除平台，评估小鼠对平台位置的记忆有多准确。在Y迷宫试验中，将小鼠放入Y字形迷宫，测定进入新臂的次数。进入新臂的次数越多，判断空间认知能力越高。

动物模型中的验证结果

本研究为验证细胞培养实验的结果，进行了使用AD模型小鼠的实验。向AD模型小鼠脑室内给予暴露于Aβ的星形胶质细胞来源EV后，突触相关蛋白的表达增加，突触的结构完整性得以改善。此外，在认知功能测试（Morris水迷宫试验）中，观察到学习能力和记忆能力的改善。

• 实验方法详情：向AD模型小鼠（例如：APP/PS1小鼠）脑室内给予暴露于Aβ的星形胶质细胞来源EV或PBS（对照组）。经过一定时间后，采集脑组织，用Western blotting测定突触相关蛋白的量。此外，用电子显微镜观察突触的形态学变化。认知功能使用Morris水迷宫试验或Y迷宫试验进行评估。

从专业视角的考察

抗衰老

本研究提示星形胶质细胞来源的EV有可能改善神经元的突触功能，从抗衰老的视角来看也颇具趣味。已知随着衰老，脑内胶质细胞的功能发生变化，对神经元的支持下降。使用星形胶质细胞来源EV的治疗，有可能成为预防或改善伴随衰老的认知功能下降的新策略。特别是，通过给予富含Rps6的EV，有望促进神经元的蛋白质合成，支持突触的维持与修复。

再生医学（MSC / EV）

间充质干细胞 (MSC) 来源的EV已被报道对各种疾病具有治疗效果，在再生医学领域备受关注。本研究表明星形胶质细胞来源的EV会给神经元带来有益的效果，提示其与MSC来源EV同样，作为针对神经退行性疾病的新治疗方法的可能性。特别是，星形胶质细胞来源的EV适应于脑内的微环境，有可能比MSC来源EV具有更高的靶向性。今后，期待进一步详细解析星形胶质细胞来源EV的特性，以开发针对神经退行性疾病的最佳EV治疗。

神经–器官关联

本研究着眼于脑内胶质细胞与神经元的相互作用，但神经系统也与其他器官密切协同，神经–器官关联这一概念至关重要。例如，已知肠道菌群会影响脑功能，被称为肠脑轴。星形胶质细胞来源的EV有可能受到肠道菌群变化的影响，且该影响有可能传递至神经元。今后，阐明星形胶质细胞来源EV如何经由神经–器官关联影响全身健康的研究十分重要。

未来展望

本研究揭示了星形胶质细胞来源的EV调控神经元局部翻译并改善突触功能这一全新机制，期待其对今后的AD研究产生重大影响。今后，进一步推进以下几点的研究十分重要。

1. EV货物（cargo）的鉴定：有必要详细解析Rps6以外的EV货物如何影响神经元的局部翻译。使用蛋白质组学分析、RNA测序等，全面鉴定EV中所含蛋白质和核酸的种类，并对各自进行功能解析，这一点十分重要。
2. 靶细胞的鉴定：有必要阐明星形胶质细胞来源的EV是否选择性地作用于特定的神经元亚型。使用single-cell RNA sequencing等，鉴定EV的靶细胞，并解析EV在该细胞中的作用机制，这一点十分重要。
3. 治疗应用：为开发使用星形胶质细胞来源EV的AD治疗方法，需要进一步的研究。优化EV的给药方法、给药量、给药时机等，并在AD模型动物中验证治疗效果，这一点十分重要。此外，对于EV的安全性及长期影响，也需要慎重评估。

总结

本研究揭示了星形胶质细胞来源的EV通过Rps6促进神经元轴突的局部翻译并改善突触功能。这一发现提示了胶质细胞通过EV调控神经元功能这一全新机制，有可能为理解AD的病理与开发治疗方法开辟新的途径。今后，期待通过着手解决EV货物的鉴定、靶细胞的鉴定、治疗应用等课题，致力于开发使用星形胶质细胞来源EV的AD治疗方法。