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MSC外泌体

三维培养通过皮质肌动蛋白解聚增强MSC来源外泌体分泌及治疗效果的分子机制

2026-01-10

期刊信息

概要 (Summary)

本研究旨在从分子水平阐明间充质干细胞 (MSC) 的三维 (3D) 培养相较于二维 (2D) 培养促进细胞外囊泡 (sEV) 分泌的机制。结果表明，在3D培养的MSC中，通过整合素α1 (ITGA1) 的下调抑制了RhoA/cofilin信号转导通路，从而诱导皮质肌动蛋白的解聚，促进sEV的释放。此外，研究显示，3D培养MSC来源的sEV在骨关节炎 (OA) 及创伤愈合的大鼠模型中，于体外 (in vitro) 及体内 (in vivo) 均能提高治疗效果。本研究阐明了RhoA/cofilin通路依赖性的皮质肌动蛋白解聚是促进sEV分泌的新机制，并为优化干细胞来源sEV的产量及治疗效果提供了新的见解。

1. 什么是”皮质肌动蛋白”？

在细胞膜的紧内侧，有一种称为”肌动蛋白丝”的蛋白质纤维呈网状交织分布。这被称为**皮质肌动蛋白（Cortical Actin）**。

2. 什么是”解聚”？

聚合（聚合物化）的纤维散开的现象称为解聚。也就是说，原本呈网状牢固组建的肌动蛋白纤维被分解，网络变得松散稀疏的状态。

3. 为何这对”外泌体分泌”很重要？

通常，细胞内的外泌体（包括含有它的囊泡）会试图排出到细胞膜之外，但皮质肌动蛋白的网络会阻碍它们，使其难以排出。

然而，一旦发生**“皮质肌动蛋白解聚”**：

  1. 屏障消失： 起阻碍作用的网络被分解而消失。
  2. 促进融合： 含有外泌体的囊泡能够顺利到达细胞膜并与之融合。
  3. 分泌增加： 结果，大量外泌体被释放到细胞外。

研究背景 (Background)

细胞外囊泡 (EV) 是承担细胞间通讯的重要介质，它通过将蛋白质、核酸、脂质等生物活性物质运输至靶细胞，影响生理及病理过程。特别是间充质干细胞 (MSC) 来源的细胞外囊泡 (sEV)，已被报道表现出组织修复、免疫调节、抗炎作用等多种治疗效果，在再生医学领域受到极大关注。然而，MSC的sEV分泌量有限，因此需要开发能够增加其产量的有效方法。

与传统的二维 (2D) 培养相比，三维 (3D) 培养系统能够使细胞形态、基因表达、细胞间相互作用更接近生理状态，被认为可以改善细胞功能并促进sEV分泌。然而，3D培养促进MSC分泌sEV的分子机制此前尚未充分阐明。本研究旨在阐明在3D培养的MSC中皮质肌动蛋白解聚促进sEV分泌的新机制，并通过详细解析其分子机理，为优化sEV的产量及治疗效果构建基础。

作者与研究室介绍 (Lab & Authors)

本论文由新加坡国立大学（National University of Singapore, NUS）的Lim Chwee Teck教授的研究室发表。

研究室介绍

Lim Chwee Teck教授隶属于新加坡国立大学生物医学工程系及机械工程系，同时也是Mechanobiology Institute (MBI) 的首席研究员（Principal Investigator）。Lim研究室聚焦于细胞及组织层面机械信号转导的作用，尤其研究机械力在癌症、血管疾病、干细胞生物学中的重要性。研究室运用微流控器件、生物材料、成像技术等多样化技术，探究细胞如何感知并响应机械刺激。迄今为止的研究成果已发表于Nature Materials、Nature Cell Biology、PNAS等一流期刊。本次论文可以说是契合研究室长期主题——3D细胞培养中细胞骨架变化对外泌体分泌影响——的研究。

Lim研究室成立于1999年，此后培养了众多研究者。据研究室网站（https://me.nus.edu.sg/bme/people/academic-staff/lim-chwee-teck/）介绍，研究室的主要研究主题如下。

  1. 细胞的机械特性与细胞骨架：研究细胞的硬度、粘弹性、变形能力等机械特性如何影响细胞功能。尤其聚焦于作为细胞骨架构成要素的肌动蛋白、肌球蛋白、中间丝等控制细胞机械特性的机制。
  2. 细胞与细胞外基质的相互作用：细胞外基质 (ECM) 不仅作为细胞的支架，还作为控制细胞存活、增殖、分化的重要信号转导分子发挥作用。研究室研究细胞如何感知并响应ECM的机械特性及组成。尤其着眼于通过整合素等细胞黏附分子介导的细胞与ECM的相互作用。
  3. 使用微流控器件进行细胞操作：由于微流控器件能够精密控制微量液体，因此是细胞生物学研究中的强大工具。研究室开发利用微流控器件测量细胞机械特性、向细胞施加机械刺激、以及分离与浓缩细胞的技术。
  4. 癌症的机械生物学：已知癌细胞表现出与正常细胞不同的机械特性。研究室研究癌细胞的硬度、变形能力、侵袭能力等机械特性如何参与癌症转移及耐药性。此外，旨在利用微流控器件开发针对癌细胞机械特性的新型治疗方法。
  5. 干细胞的机械生物学：干细胞是具有自我复制能力和多分化潜能的特殊细胞，有望应用于再生医学。研究室研究干细胞的机械特性，以及干细胞响应机械刺激而分化的机制。此外，旨在利用微流控器件开发控制干细胞分化的技术。

本次论文可以说是契合研究室长期主题——3D细胞培养中细胞骨架变化对外泌体分泌影响——的研究。尤其被认为着眼于与细胞外基质的相互作用以及细胞的机械特性如何影响外泌体分泌这一点。

作者介绍

本论文的责任作者（Corresponding Author）是Lim Chwee Teck教授。如上所述，Lim教授是新加坡国立大学的著名研究者，也是生物工程领域的领军人物之一。他的研究将细胞力学、微流控工程以及生物医学应用相结合，尤其聚焦于癌症、干细胞以及细胞外囊泡的研究。Lim教授因其对研究领域的显著贡献而屡获奖项。例如，他于2016年获得新加坡总统科学技术奖。

Lim教授迄今已发表400余篇论文，其成就在国际上获得高度评价。他的研究对细胞生物学、生物材料以及再生医学领域产生了重大影响，今后的活跃表现也备受期待。

促成本次研究的背景

Lim研究室多年来一直研究细胞机械特性与细胞功能之间的关系。尤其着眼于与细胞外基质 (ECM) 的相互作用，以及施加于细胞的力学应力如何影响细胞的存活、增殖、分化以及细胞外囊泡的分泌。本次研究作为其中一环，着眼于3D细胞培养对细胞机械特性的影响，并详细解析了它如何影响外泌体分泌。考虑到3D细胞培养比2D细胞培养更接近生理状态，研究室此前便一直致力于使用3D细胞培养的细胞功能研究。本次研究是其成果之一，在从分子水平阐明3D细胞培养促进外泌体分泌的机制这一点上，被认为具有非常重要的意义。

主要发现 (Key Findings – 分子、细胞、组织层面)

实验系统与动物模型概要

1. 分子层面的详细解说

1.1 整合素α1 (ITGA1) 的下调

在3D培养的hMSC中，经蛋白质印迹法（Western blotting）确认，与2D培养相比整合素α1 (ITGA1) 的表达显著降低（Figure 1A）。ITGA1是与细胞外基质 (ECM) 的胶原蛋白、层粘连蛋白等成分结合的细胞表面受体，在细胞黏附、细胞迁移、细胞分化等细胞功能中发挥重要作用。在3D培养环境中，细胞被认为通过改变与ECM的相互作用、抑制ITGA1的表达，从而诱导细胞骨架的重构。具体而言，将细胞裂解后提取蛋白质，经SDS-PAGE电泳分离后转印至PVDF膜。使用针对ITGA1的一抗（例如：Abcam ab30393）与HRP标记的二抗进行检测。以化学发光法使条带可视化，并用ImageJ软件进行定量分析。ITGA1的表达水平以管家基因（例如：GAPDH）进行标准化。

1.2 RhoA/cofilin信号转导通路的抑制

ITGA1的下调引起RhoA/cofilin信号转导通路的抑制。RhoA是一种小分子量GTPase，参与肌动蛋白细胞骨架的收缩及细胞黏附的调节。cofilin是使肌动蛋白丝解聚的蛋白质，它被由RhoA激活的ROCK（Rho-associated kinase）磷酸化，其活性由此受到调节。在3D培养的hMSC中，经蛋白质印迹法确认，RhoA及cofilin的磷酸化水平显著降低（Figure 1B, C）。这提示，由于ITGA1的下调，RhoA的激活受到抑制，结果使cofilin的磷酸化降低，促进了肌动蛋白丝的解聚。RhoA的激活可通过测定GTP结合型RhoA的量来评估。从细胞裂解液中以pull-down实验分离GTP结合型RhoA，并以蛋白质印迹法检测。cofilin的磷酸化使用磷酸化cofilin特异性抗体进行检测。

1.3 肌动蛋白解聚的促进

RhoA/cofilin信号转导通路的抑制促进肌动蛋白解聚。肌动蛋白是细胞骨架的主要构成要素，参与细胞形态维持、细胞运动、细胞内运输等多种细胞功能。肌动蛋白呈球状的G-肌动蛋白和线状的F-肌动蛋白两种形态，通过反复进行聚合与解聚，使细胞骨架的动态重构成为可能。在3D培养的hMSC中，经荧光显微镜观察及蛋白质印迹法确认，F-肌动蛋白的量减少，G-肌动蛋白的量增加（Figure 2A, B）。这提示，由于RhoA/cofilin信号转导通路的抑制，肌动蛋白丝的解聚被促进，细胞骨架变得更加柔韧。肌动蛋白聚合的评估使用荧光标记的鬼笔环肽（phalloidin）进行。由于鬼笔环肽特异性结合F-肌动蛋白，因此通过荧光显微镜观察可评估F-肌动蛋白的分布及量。此外，也可将细胞裂解后分离G-肌动蛋白与F-肌动蛋白，并以蛋白质印迹法分别定量各自的量。

1.4 Rab27A/B敲低对sEV分泌的抑制

Rab27A及Rab27B是一种小分子量GTPase，参与细胞内囊泡运输，尤其是细胞外囊泡 (EV) 的分泌。已知这些蛋白质调节EV与细胞膜融合并释放至细胞外的过程。本研究制作了敲低Rab27A及Rab27B的hMSC，并研究其对sEV分泌的影响。结果表明，Rab27A及Rab27B的敲低显著抑制了sEV分泌（Figure 3A）。具体而言，Rab27A的敲低使sEV分泌减少至约0.5倍，Rab27B的敲低使sEV分泌减少至约0.1倍。该结果提示，Rab27A及Rab27B在hMSC的sEV分泌中发挥着必不可少的作用。Rab27A/B的敲低使用siRNA或shRNA进行。将siRNA或shRNA导入hMSC，以抑制Rab27A/B的表达。敲低的效率以qRT-PCR或蛋白质印迹法确认。

1.5 2D/3D培养中Rab27A/B表达量的变化

有趣的是，在2D培养与3D培养之间，Rab27A及Rab27B的表达量未见显著差异（Figure 3B）。这提示，3D培养对sEV分泌的促进并非由于Rab27A及Rab27B表达量的变化。相反，3D培养所诱导的皮质肌动蛋白解聚被认为是通过独立于Rab27A/B的通路促进sEV分泌的。qRT-PCR中测定Rab27A/B的mRNA量。提取总RNA，逆转录为cDNA后，使用Rab27A/B特异性引物进行PCR。表达量以管家基因（例如：GAPDH）进行标准化。蛋白质印迹法中，使用针对Rab27A/B的抗体测定蛋白质的表达量。

2. 细胞层面的详细解说

2.1 hMSC的形态变化

经相差显微镜观察确认，3D培养的hMSC与2D培养相比，呈现出更接近球状的形态（Figure 4A）。这提示，在3D培养环境中，细胞减弱与支架的黏附、重构细胞骨架，从而采取更为自由的形态。细胞形态的观察使用相差显微镜或共聚焦激光显微镜进行。将细胞固定后，对细胞膜及细胞骨架进行染色，并在显微镜下观察。在3D培养中，还可观察到细胞浸润至支架内部的情形。

2.2 肌动蛋白细胞骨架的重构

经荧光显微镜观察确认，3D培养的hMSC中，肌动蛋白细胞骨架被更为柔韧地重构（Figure 4B）。在2D培养中，肌动蛋白丝沿细胞膜平行排列，而在3D培养中，观察到肌动蛋白丝排列得更为随机，并均匀分布于整个细胞。这提示，3D培养所诱导的皮质肌动蛋白解聚提高了细胞骨架的柔韧性，并促进细胞形态变化及细胞运动。肌动蛋白细胞骨架的可视化使用荧光标记的鬼笔环肽（phalloidin）进行。由于鬼笔环肽特异性结合F-肌动蛋白，因此通过荧光显微镜观察可详细观察肌动蛋白丝的分布及结构。

2.3 sEV释放量的增加

经纳米颗粒跟踪分析（NTA）确认，3D培养的hMSC与2D培养相比，sEV的释放量显著增加（Figure 5A）。NTA是测定液体中微粒（如sEV）的尺寸及浓度的技术，在sEV研究中被广泛使用。3D培养使sEV释放量增加约2倍，这提示3D培养是提高sEV生产效率的有效手段。sEV的释放量通过回收培养上清液，经离心分离去除细胞及碎片（debris）后，以NTA测定。NTA中，照射激光，并解析来自微粒的散射光，从而计算颗粒的尺寸及浓度。

2.4 sEV摄取量的变化

sEV通过胞吞作用等机制被靶细胞摄取，并将其内部所含的蛋白质、核酸等生物活性物质运输至靶细胞，从而介导细胞间通讯。经荧光显微镜观察及流式细胞术确认，3D培养hMSC来源的sEV与2D培养hMSC来源的sEV相比，被靶细胞（例如软骨细胞或成纤维细胞）摄取的量增加（Figure 5B）。该结果提示，3D培养提高了sEV的细胞摄取能力，可能有助于提升sEV的治疗效果。sEV的摄取能力使用荧光标记的sEV进行评估。将sEV以荧光染料（例如DiI或CFSE）标记，添加至靶细胞后培养一定时间。随后洗涤细胞，并以荧光显微镜或流式细胞术测定被摄取至细胞内的sEV量。

3. 组织层面的详细解说

3.1 骨关节炎 (OA) 模型中的软骨保护效果

骨关节炎 (OA) 是以关节软骨的变性及破坏为特征的慢性关节疾病，是显著降低老年人生活质量（QOL）的因素之一。本研究中，向OA大鼠模型给予3D培养hMSC来源的sEV后，经组织学分析（苏木精-伊红染色、番红O染色、甲苯胺蓝染色）确认，软骨破坏受到抑制，软骨细胞的存活率得到提高（Figure 6A, B）。这些结果提示，3D培养hMSC来源的sEV具有抑制OA进展、保护软骨的效果。组织学分析中，摘取关节组织，石蜡包埋后制作薄切片，进行各种染色。苏木精-伊红染色可观察细胞形态及组织结构。番红O染色及甲苯胺蓝染色可评估软骨蛋白聚糖的量。软骨破坏的程度使用OARSI评分等评估标准进行定量化。

3.2 创伤愈合模型中的创伤闭合促进效果

创伤愈合是修复皮肤损伤的复杂过程，经过炎症、细胞增殖、组织重塑等阶段而进展。本研究中，向创伤愈合大鼠模型给予3D培养hMSC来源的sEV后，经肉眼观察及组织学分析（苏木精-伊红染色、马松三色染色）确认，创伤闭合得到促进，肉芽组织的形成得到促进（Figure 7A, B）。这些结果提示，3D培养hMSC来源的sEV具有促进创伤愈合的效果。创伤闭合的程度通过测定创伤面积进行评估。肉芽组织的形成以苏木精-伊红染色观察，并评估血管新生的程度及胶原蛋白沉积的量。马松三色染色可详细观察胶原蛋白的分布。

4. 动物模型验证结果的详细解说

4.1 骨关节炎 (OA) 模型

4.2 创伤愈合模型

5. 实验数据的具体解读

5.1 Figure 1：ITGA1及RhoA/cofilin通路的分析

5.2 Figure 2：肌动蛋白解聚的分析

5.3 Figure 3：Rab27A/B的敲低效果

5.4 Figure 6：OA模型中的软骨保护效果

5.5 Figure 7：创伤愈合模型中的创伤闭合促进效果

专业视角下的考察 (Discussion / Implications)

抗衰老的视角

已知间充质干细胞 (MSC) 随着衰老其功能会下降。本研究所示的3D培养促进sEV分泌的机制，有可能成为改善衰老MSC的sEV分泌能力、增强抗衰老效果的新策略。例如，通过与3D培养技术相结合，有望提高衰老MSC来源sEV的治疗效果。肌动蛋白细胞骨架的动态调控对于保持细胞的年轻状态至关重要，针对RhoA/cofilin通路的药物或小分子化合物有可能成为抗衰老治疗的候选。

再生医学（MSC / EV）的视角

MSC来源的sEV在再生医学领域，作为替代细胞移植的新型治疗方法而备受关注。本研究表明，3D培养能够提高sEV的生产效率并提升治疗效果。这可以说是加速基于sEV的再生医学实用化的重要成果。尤其，针对骨关节炎及创伤愈合等慢性疾病的sEV疗法的开发备受期待。此外，通过优化sEV的给药方法、给药剂量、给药间隔等，有望进一步提升治疗效果。

神经–器官关联的视角

有提示称，sEV有可能介导神经系统与其他器官之间的通讯。本研究所示的sEV治疗效果，有可能反映了经由神经–器官关联的组织修复机制。例如，可以设想sEV作用于神经系统的细胞，促进神经营养因子的分泌或抑制炎症，从而间接促进组织修复。在今后的研究中，详细解析sEV对神经系统的影响、阐明经由神经–器官关联的sEV治疗效果至关重要。

未来展望 (Future Prospects)

本研究阐明了3D培养促进MSC来源sEV分泌的机制，为开发基于sEV的新型治疗方法开辟了道路。在今后的研究中，以下几点将至关重要。

  1. 临床应用：基于本研究所获得的见解，有必要针对骨关节炎及创伤愈合等慢性疾病实施sEV疗法的临床试验，评估其安全性及有效性。此外，通过优化sEV的给药方法、给药剂量、给药间隔等，有望进一步提升治疗效果。
  2. sEV的质量管理：由于sEV的质量对治疗效果有重大影响，因此有必要建立sEV的质量管理技术。具体而言，需严格管理sEV的尺寸、浓度、蛋白质组成、核酸组成等，将批次间的偏差降至最低。
  3. sEV的靶向化：将sEV选择性递送至靶细胞是提升治疗效果的重要课题。通过在sEV表面修饰特定分子，有望提高sEV与靶细胞的结合能力，并提升治疗效果。
  4. 个体化医疗：人们期望实现根据患者的疾病状态及遗传背景选择最佳sEV疗法的个体化医疗。具体而言，通过分析患者的血液及组织样本、预测对sEV的敏感性，将有可能提供更为有效的治疗。

总结 (Conclusion)

本研究阐明了，在3D培养的MSC中，通过ITGA1的下调抑制RhoA/cofilin信号转导通路，从而诱导皮质肌动蛋白的解聚，促进sEV的释放。此外，研究显示，3D培养MSC来源的sEV在OA及创伤愈合的大鼠模型中能够提高治疗效果。这些结果阐明了RhoA/cofilin通路依赖性的皮质肌动蛋白解聚是促进sEV分泌的新机制，并为优化干细胞来源sEV的产量及治疗效果提供了新的见解。期待今后的研究能够加速基于sEV的再生医学的实用化，为众多患者提供新的治疗选择。