عددنا الجسيمات النانوية الدهنية الناقلة لـmRNA واحدًا واحدًا: المحمول فيها 2.8 جزيئة في المتوسط، و80% من الجسيمات تسير «فارغة الحمولة»

الجسيمات النانوية الدهنية (lipid nanoparticle, LNP) عربات نقل تغلّف mRNA الهشّ داخل كريّة دهنية وتوصله إلى داخل الخلية. وقد دخلت حيّز الاستخدام العملي دفعةً واحدة مع لقاحات mRNA، وهي تُستخدم اليوم أيضًا في علاجات توصّل أدوات التحرير الجيني إلى الكبد.

وهنا نطرح سؤالًا بسيطًا. كم جزيئة mRNA يحتوي الجسيم الواحد؟

لم يكن في مقدور أحد تقريبًا أن يجيب فورًا. فما يظهر في بطاقة جودة المستحضر رقم من نوع «كفاءة التغليف (encapsulation efficiency, EE) 94%». ومعناه أنّ 94% من mRNA الذي أُدخل في التحضير قد صار داخل الجسيمات، أي إنّها نسبة محسوبة من جهة mRNA. وهي لا تقول حرفًا واحدًا عن السؤال من جهة الجسيم: «كم جزيئة في الجسيم الواحد؟» و«كم عدد الجسيمات التي تسير فارغة اليدين؟».

وما نتناوله اليوم ورقة من عام 2022 في Nature Communications أجابت عن ذلك السؤال جسيمًا جسيمًا. ولنكتب الخلاصة أولًا. في جسيمات LNP المحضّرة بصيغة مختبرية قياسية، كان المتوسط لكلّ جسيم من بين الجسيمات التي تحمل mRNA هو 2.80 جزيئة، والقيمة الأكثر تكرارًا 2. وأمّا مجموع الجسيمات، فإنّ 77% منها لم تكن تحمل أيّ جزيئة mRNA على الإطلاق.

ولنضع تحذيرَين في البداية. أوّلًا، هذه ورقة من عام 2022. وسبب تناولها مع ذلك أنّ الرقم الذي خرج منها — «الأغلبية فارغة» — صار، في نظري، نقطةَ انطلاقٍ للتفكير في هذا المجال منذ ذلك الحين، وأنّ منطق القياس فيها ينطبق انطباقًا مباشرًا على بحوثنا في الحويصلات خارج الخلوية (extracellular vesicle, EV). ثانيًا، ما قِيس هو mRNA تجاري موسوم بصبغة، وصيغة مختبرية «كلاسيكية» تستخدم DLin-MC3-DMA دهنًا متأيّنًا. وليست هذه ورقة قاست لقاح كوفيد-19 نفسه. فلا يجوز الخلط بين الأمرين.

معلومات النشر

• عنوان الورقة: Payload distribution and capacity of mRNA lipid nanoparticles (توزّع الحمولة وسعتها في الجسيمات النانوية الدهنية الحاملة لـmRNA)
• نوع الورقة: بحث أصلي (تطوير تقنية قياس + كيمياء فيزيائية للمستحضرات)
• المجلة: Nature Communications 2022، المجلد 13، رقم المقال 5561 (وردت في 13 يناير 2022، قُبلت في 5 سبتمبر، نُشرت إلكترونيًّا في 23 سبتمبر)
• DOI / الرابط: 10.1038/s41467-022-33157-4
• الترخيص: وصول مفتوح (CC BY 4.0). النصّ الكامل متاح للجميع
• Impact Factor: بحسب التقدير نحو 15 (يتغيّر من سنة إلى أخرى. وهي واحدة من أرفع المجلات في فئة المجلات العلمية العامة)
• المؤلفون: Sixuan Li، Yizong Hu (وهذان مؤلفان أوّلان مشتركان)، Andrew Li، Jinghan Lin، Kuangwen Hsieh، Zachary Schneiderman، Pengfei Zhang، Yining Zhu، Chenhu Qiu، Efrosini Kokkoli، Tza-Huei Wang، Hai-Quan Mao — 12 مؤلفًا
• الانتماءات: جميعهم من جامعة جونز هوبكنز (بالتيمور، ولاية ماريلاند، الولايات المتحدة). قسم الهندسة الميكانيكية، معهد التقانة الحيوية النانوية (INBT)، قسم الهندسة الطبية الحيوية في كلية الطب، Translational Tissue Engineering Center، قسم الهندسة الكيميائية والجزيئية الحيوية، قسم علوم وهندسة المواد
• المؤلفون المسؤولون: Yizong Hu وTza-Huei Wang وHai-Quan Mao، 3 (ونُصّ على أنّ Wang وMao «أسهما إسهامًا متساويًا كمؤلفَين مسؤولَين مشتركَين»)
• التمويل: المعهد الوطني الأمريكي للحساسية والأمراض المعدية (NIAID)، المنحتان U01AI155313 (لـMao) وR01AI137272 (لـWang)
• الإفصاح عن تضارب المصالح: 4 من المؤلفين — Li وHu وWang وMao — لديهم طلب براءة اختراع قيد النظر يشمل التقنية الواردة في هذه الورقة (عبر مكتب Office of Technology Ventures في جامعة جونز هوبكنز). ولم يُصرّح باقي المؤلفين بشيء
• مراجعة الأقران: بحسب سياسة Nature Communications فإنّ تقارير المراجعة منشورة، وقد أُفصح عن اسم Xucheng Hou كواحد من المراجعين

أيّ باحثين هم المؤلفون المسؤولون؟

Hai-Quan Mao يقود معهد التقانة الحيوية النانوية (INBT) في جامعة جونز هوبكنز، ويشغل في الوقت نفسه كرسي الأستاذية في قسم علوم وهندسة المواد وفي قسم الهندسة الطبية الحيوية بكلية الطب. ومساره غير معتاد قليلًا: حصل على البكالوريوس في الكيمياء (1988) والدكتوراه في كيمياء البوليمرات (1993) من جامعة ووهان في الصين، وعمل محاضرًا فيها، ثم قضى 1995–1998 باحثًا بعد الدكتوراه في جامعة جونز هوبكنز. وفي 1999–2003 كان الباحث الرئيسي المشارك في Johns Hopkins Singapore، وفي 2001–2003 شغل في الوقت نفسه منصب أستاذ مساعد في جامعة سنغافورة الوطنية، ثم انضمّ في 2003 إلى هيئة التدريس في Whiting School of Engineering بجامعة جونز هوبكنز. وفي 2016 صار نائب مدير INBT، وهو مديره الآن. وهو زميل الجمعية الملكية البريطانية للكيمياء (2014)، وزميل المعهد الأمريكي للهندسة الطبية والحيوية (AIMBE) (2018)، وزميل الأكاديمية الوطنية للمخترعين NAI (2023).

ولبحثه ركيزتان. الأولى طريقة تُسمّى flash nanocomplexation، واختصارها FNC، وهي جعل عملية خلط الأحماض النووية أو البروتينات مع البوليمرات لتكوين جسيمات نانوية عمليةً قابلة للتوسيع الصناعي. والثانية المركّب النانوي الليفي الهيدروجيلي (nanofiber-hydrogel composite, NHC)، وهو مادة سَقالة قابلة للحقن، تُنسَج فيها شُدَف من ألياف بولي كابرولاكتون (PCL) النانوية المنسوجة كهربائيًّا داخل شبكة هلامية من حمض الهيالورونيك بروابط تساهمية.

وهذه نقطة تهمّني شخصيًّا، فلأكتبها مقدَّمًا. فمختبر Mao هذا قد مضى فعليًّا في بحوث تستخدم ذلك المركّب NHC في إصابة الحبل الشوكي. فورقة Biomaterials 2020، المجلد 245، رقم المقال 119978 (المؤلفة الأولى Xiaowei Li، والمؤلف الأخير Mao) دراسة حقنت NHC في نموذج رضّ الحبل الشوكي (contusion) في الجرذ، ثم في ورقة Cells 2022، المجلد 11، العدد 7، رقم المقال 1137 (المؤلفة الأولى Agnes Haggerty، وشارك فيها Mao وMartin Oudega، وصول مفتوح) حُقن في الحبل الشوكي المصاب مزيجٌ من الخلايا اللحمية الوسيطة المشتقّة من نقي العظم (mesenchymal stromal cell, MSC) مع NHC. أي إنّ المؤلف المسؤول عن ورقة اليوم هو شخص يُجري في المختبر نفسه كيمياءَ mRNA-LNP الفيزيائية والطبَّ التجديدي الذي يجمع MSC بإصابة الحبل الشوكي. وسنعود إلى هذا في الجزء الأخير.

Tza-Huei (Jeff) Wang هو أستاذ كرسي Louis M. Sardella (وهو كرسي موقوف أُنشئ في 2021) في قسم الهندسة الميكانيكية بالجامعة نفسها، ويشغل في الوقت نفسه موقعًا في قسم الهندسة الطبية الحيوية، ويرأس BioMEMS and Single Molecule Dynamics Lab. حصل على الدكتوراه في الهندسة الميكانيكية من جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلس (UCLA) في 2002، وانتقل في العام نفسه إلى جامعة جونز هوبكنز، وصار أستاذًا كامل الرتبة من يوليو 2013. وهو زميل AIMBE (2017، اختير لأعماله في المستشعرات الحيوية النانوية وتحليل الأمراض الوراثية واللاجينية بكشف الجزيئة الواحدة). له أكثر من 150 ورقة وأكثر من 20 براءة اختراع.

والتقنية المحورية في هذه الورقة هي نفسها من اختراع مختبر Wang. فـCICS (cylindrical illumination confocal spectroscopy، التحليل الطيفي متحد البؤرة بالإضاءة الأسطوانية) المستخدم في النصّ طريقة نشرها المختبر نفسه في Biophysical Journal 2008، المجلد 95، الصفحة 2964. وموضوعه المعتاد يتّجه نحو الخَزعة السائلة (الحمض النووي الضئيل في الدم): قراءة مَثيلته بطريقة digital high-resolution melting للكشف المبكّر عن السرطان. والنقطة المشتركة مع تحليل LNP هنا واحدة بعينها: العدّ الدقيق لعدد قليل جدًّا من الجزيئات واحدًا واحدًا.

أمّا Yizong Hu، المؤلف الأول المشترك والمؤلف المسؤول، فهو بحسب بند إسهامات المؤلفين مَن تصوّر هذا البحث. حصل على البكالوريوس في المواد البوليمرية من جامعة تسينغهوا (2016)، والدكتوراه في الهندسة الطبية الحيوية من جامعة جونز هوبكنز (2022). وبحسب ملفه الشخصي المنشور، انتقل بعد ذلك إلى معهد ماساتشوستس للتقانة (MIT) باحثًا بعد الدكتوراه يعمل على التوصيل الجيني غير الفيروسي.

ما الذي لم يكن معروفًا حتى الآن؟

السؤال الذي لا تجيب عنه «كفاءة التغليف 94%»

كفاءة التغليف هي ما يُذكر لا محالة عند الحديث عن جودة LNP. وطريقة قياسها بسيطة: نستخدم صبغة ترتبط بالحمض النووي فتتوهّج، مثل RiboGreen، ونقارن التوهّج «قبل تفكيك الجسيمات بخافض للتوتر السطحي» و«بعد تفكيكها». فقبل التفكيك لا يتوهّج إلا mRNA الموجود في الخارج، وبعد التفكيك يتوهّج الكلّ. ومن الفرق بينهما نحصل على «كم في المئة كان داخل الجسيمات».

👦 طالب: إذا كان 94% منه داخلها، فأظنّ ذلك كافيًا.

🧬 إكسوتارو: لا، السؤال مختلف. فهذا تعدادٌ للشحنات. إنّه يقول: «من بين 100 شحنة أُرسلت، حُمّلت 94 على الشاحنات». لكن ما نريد معرفته هو حال الشاحنات نفسها: «كم شاحنة تسير، وكم شحنة في الشاحنة الواحدة، وكم شاحنة تسير فارغة؟». وهذا ما لا يكشفه التعداد أبدًا.

وليست هذه لعبة لفظية. فمعرفة الحمولة في الجسيم الواحد تعطينا عدد الجسيمات. ومعرفة عدد الجسيمات تفتح بابًا للنقاش: كم جسيمًا يجب أن تبتلعه الخلية الواحدة ليظهر الأثر؟ وإذا كانت الجسيمات الفارغة كثيرة، فمعنى ذلك أنّنا نُعطي المريض دهونًا لا تُسهم في الأثر الدوائي. ومن المعروف أنّ الدهون نفسها قد تحرّض المناعة أو تُحمّل الكبد عبئًا، فالمسألة متّصلة اتصالًا مباشرًا بالسلامة أيضًا.

لماذا لم يستطع أحد قياس ذلك؟

لم تكن أيٌّ من طرائق القياس القائمة كافية؛ كان ينقص كلًّا منها خطوة واحدة.

المجهر الإلكتروني بالتبريد (cryo-TEM) يتيح رؤية الجسيمات مباشرة. لكن عند الأس الهيدروجيني الفيزيولوجي pH 7.4 يفقد الدهن المتأيّن شحنته فيُكوّن في مركز الجسيم لبًّا لا متبلّرًا كارهًا للماء، ولذلك يظهر الجسيم معتمًا ومكتنزًا بالقدر نفسه سواء كان فيه mRNA أم لا. وقد صوّرت هذه الورقة أيضًا جسيمات LNP فارغة حُضّرت بلا mRNA، فلم يكن التمييز ممكنًا.

واستطارة النيوترونات ذات الزاوية الصغيرة، وNMR، وتحليل تتبّع الجسيمات النانوية (NTA) تصطدم بالجدار نفسه. فهي تُخرج حجم الجسيمات أو بنيتها الوسطية، لكنّها لا تستطيع الحكم جسيمًا جسيمًا على وجود محتوى أو غيابه.

ولهذا اختار المؤلفون التوهّج. لكنّ المجهر العادي لا يكفي. فالمطلوب جهاز يُمرّر الجسيمات واحدًا واحدًا دون أن يُفلت منه شيء تقريبًا، ويسجّل أيّ الألوان توهّجت في الوقت نفسه (وتعبير الورقة هو «كفاءة الكشف الكتلي نحو 100%»).

CICS — تمرير الجسيمات واحدًا واحدًا عبر «بوابة العبور» في الشعيرة

وفكرة CICS كالتالي: نَدفع العيّنة بالضغط (غاز الأرغون عند 42 psi) داخل شعيرة من الكوارتز قطرها الداخلي 10 µm، أي بسُمك شعرة. وسرعة التدفّق 1 mm/ثانية. ثم نجمع ثلاثة ليزرات (488 nm و552 nm و640 nm) في حزمة واحدة بمُجمِّع حِزَم، ونُسقطها على شكل «صفيحة ضوء» مُمتدّة عرضيًّا بعدسة أسطوانية.

👦 طالب: ولماذا صفيحة لا نقطة عادية؟

🧬 إكسوتارو: لسدّ عرض بوابة العبور كلّه. فلو ضُيّق الليزر إلى نقطة، لتوهّجت بسطوع الجسيماتُ التي تمرّ في وسط الشعيرة وحدها، ولبدت المارّة قرب الحافة معتمة. وحينها لا نستطيع التمييز بين «الجسيم المعتم» و«الجسيم القليل المحتوى». أمّا إذا غطّت صفيحة الضوء المقطع العرضي بأكمله، فإنّ الجسيم يتوهّج بالسطوع نفسه أيًّا كان موضع مروره. وتُعبّر الورقة عن ذلك بأنّ كفاءة الكشف الكتلي تبلغ 100% تقريبًا. أي إنّ الجميع يعبر البوابة، وبالشرط نفسه كذلك.

وأجهزة الكشف ثلاثة صمّامات ثنائية ضوئية انهيارية (APD) تعدّ الفوتونات المفردة. والتسجيل بخطوات 0.1 ميلي ثانية، فتُجمع لكلّ صيغة أكثر من 50,000 حدث في 20 دقيقة (بمعدّل 3,000 إلى 5,000 حدث في الدقيقة).

ثم تُستخدم ثلاثة وسوم بتوزيع للأدوار.

وبـتركيبة التوهّج المتزامن لهذه الألوان الثلاثة يُفرَّق بين ثلاثة أنواع.

• LNP الحامل لـmRNA = YOYO-1 (−)، TMR (+)، Cy5 (+)
• LNP الفارغ = TMR (+) وحده
• mRNA عارٍ غير مُغلَّف = YOYO-1 (+)، Cy5 (+)، TMR (−)

كيف عُدّ «واحد أو اثنان أو ثلاثة»؟

وهذا أكثر أجزاء الورقة براعةً تقنية. فسطوع Cy5 يتحدّد تقريبًا بعدد جزيئات mRNA، لكنّه في الوقت نفسه رهنٌ بـتبدّد عدد جزيئات Cy5 على الجزيئة الواحدة، والتذبذب البواسوني في انبعاث الفوتونات وكشفها، وتغيّر خَرج الليزر وسرعة التدفّق. فلا يمكن إذن الجزم جسيمًا جسيمًا بأنّ «هذا الجسيم ساطع فهو يحمل 3».

فاستعمل المؤلفون بديلًا عن ذلك أسلوب حلّ التوزيع (فكّ الالتفاف، deconvolution).

1. أولًا نقيس عمليًّا توزيع سطوع جزيئة mRNA عارية واحدة (وتكتبه الورقة D(RNA,1))
2. وإذا ضربنا سطوع ذلك التوزيع في n، حصلنا على توزيع «الجسيم الذي يحمل n بالضبط»، أي D(RNA,n)
3. ثم نُعدّل الأوزان w(n) حتى يصبح توزيع LNP المقيس عمليًّا قابلًا لإعادة التكوين بـجمع موزون لـD(RNA,1) وD(RNA,2) و…
4. ومجموعة الأوزان المثلى تصبح هي نفسها الجواب: نسبة الجسيمات التي تحمل جزيئة واحدة، ونسبة التي تحمل جزيئتين، وهكذا

والتحسين يجري بطريقة التلدين المحاكى في MATLAB، مع فرض معامل جزاء α = 0.1 حتى لا يحيد مجموع الأوزان عن العدد الكلّي المقيس للجسيمات بأكثر من 1%. وقد ضُبط الحدّ الأعلى للحمولة المأخوذة في الحساب عند 6 أضعاف القيمة المقدَّرة للحمولة الوسطية (وهي نسبة المتوسط الهندسي لتوهّج LNP الحامل لـmRNA إلى توهّج mRNA العاري).

👦 طالب: تقولون «نعدّ جسيمًا جسيمًا»، لكنّ الأمر في النهاية تقديرٌ لتوزيع.

🧬 إكسوتارو: ملاحظة حادّة. فالحكم على وجود المحتوى أو غيابه يجري جسيمًا جسيمًا، أمّا «كم العدد» فهو تقدير على مستوى المجموع. وهذا تمييز ينبغي فهمه بدقّة، وسنعود إليه مرّة أخرى في القراءة النقدية.

ما الذي كشفته هذه الورقة؟

① القيم المقيسة للصيغة القياسية — 77% كانت فارغة الحمولة

ما قِيس هو الصيغة المرجعية الشائعة في المراجع: الدهن المتأيّن DLin-MC3-DMA، والدهن المساعد DSPC، والكوليسترول، والدهن المرتبط بـPEG وهو DMG-PEG2000، بنسبة مولية 50:10:38.5:1.5. وأمّا mRNA فهو منتج موسوم بـCy5 طوله 1929 نوكليوتيدة (nt)، بتركيز نهائي 20 µg/mL، ونسبة N/P تساوي 6 (أي النسبة المولية بين مجموعات الأمين في الدهن المتأيّن ومجموعات الفوسفات في mRNA). ويُضخّ محلول الدهون في الإيثانول بمعدّل 1 mL في الدقيقة، ومحلول mRNA المائي بمعدّل 3 mL في الدقيقة، إلى وصلة على شكل حرف T فيختلطان، ثم تجري الديلزة عبر غشاء حدّ قطعه الجزيئي 3,500 عند 4 ℃ ولمدة 12 ساعة.

والأمر الحاسم أنّهم قاسوا الحالتين كلتيهما: الحالة الحمضية كما هي عند pH 4.0، والحالة بعد العودة إلى التعادل عند pH 7.4.

⚠️ لا بدّ من تنبيه واحد يتعلّق بالمصطلح. فالجدول 2 في الورقة يسمّي الأولى «Before dialysis at pH 4.0، أي قبل الديلزة = جسيم LNP الأوّلي»، لكن بقراءة بند الطرائق نجد أنّ عيّنات pH 4.0 قد خضعت هي أيضًا للديلزة 12 ساعة — مقابل محلول أسيتات منظّم، لإخراج الإيثانول. أي إنّ المقارنة بدقّة ليست بين «قبل الديلزة وبعدها»، بل بين «ما خضع للديلزة وهو حمضي» و«ما خضع للديلزة حتى التعادل». وبما أنّ تسمية الورقة نفسها تتعارض مع وصف الطرائق فيها، فسنتبع فيما يلي تسمية الورقة مع إبقاء هذه النقطة في الذهن أثناء القراءة. فبطل الآلية هو على كلّ حال نزع البروتونات الناتج عن انتقال الأس الهيدروجيني، لا «الديلزة من عدمها».

وعند pH 4.0، الذي تسمّيه الورقة «قبل الديلزة»، ظهرت ثلاث مجموعات.

• معقّد mRNA المُحبّ للدهون 34% (TMR+ وCy5+. يحمل قدرًا معتبرًا من الدهن المساعد)
• معقّد mRNA غير المُحبّ للدهون 25% (TMR− وCy5+. لا يحمل الدهن المساعد تقريبًا، وهو كتلة شديدة الشحنة من mRNA والدهن المتأيّن)
• LNP الفارغ 41%

وعند pH 7.4، أي بعد الديلزة، يتغيّر الوضع تغيّرًا تامًّا.

• LNP الحامل لـmRNA 23%
• LNP الفارغ 77%
• وmRNA العاري غير المُغلَّف لم يُشكّل سوى 4% من مجموع الأحداث

انتبه إلى أنّ هناك مقامَين مختلفَين. فنسبتا 23% و77% محسوبتان على مقام الأحداث التي توهّج فيها TMR، أي الجسيمات الدهنية، أمّا 4% فنسبة محسوبة على مقام جميع الأحداث المكتشفة (وهكذا كُتب في شرح الشكل 2 في الورقة). ولهذا يبلغ مجموع الأولَيين 100%، وmRNA العاري غير داخل فيه.

ثم الحمولة. كان المتوسط العددي لجسيمات LNP الحاملة لـmRNA 2.80 ± 0.41 جزيئة، والقيمة الأكثر تكرارًا 2، ونحو ثلاثة أرباعها يحمل من 1 إلى 3 جزيئات (n = 6، تجارب تحضير مستقلّة). وعند pH 4.0 كان المعقّد المُحبّ للدهون 3.43 ± 0.38، والمعقّد غير المُحبّ للدهون 1.34 ± 0.20، والمجموع 2.51 ± 0.24.

والقيم المقيسة التكميلية متوافرة كذلك. فقطر الجسيم (المتوسط z باستطارة الضوء الديناميكية) 106.3 ± 13.0 nm عند pH 4.0، و120.5 ± 6.0 nm عند pH 7.4. وجهد زيتا ينتقل من +45.1 ± 0.9 mV إلى −6.3 ± 1.3 mV. وكفاءة التغليف 94.2% ± 3.6% بطريقة RiboGreen، و85.6% ± 5.1% إذا حُسبت من تعداد CICS.

وأظهر المؤلفون كذلك أنّ التفريق بثلاثة ألوان كان ضروريًّا بالفعل. فالتفريق بلونين دون YOYO-1 يؤدّي إلى تصنيف ما يصل إلى 10.4% من الأحداث خطأً على أنّها LNP حاملة لـmRNA. أي إنّ العناء المبذول كان ذا معنى.

② لماذا تزيد الجسيمات الفارغة؟ — أثناء الديلزة «تنشقّ الجسيمات ثم تتلاصق»

عند pH 4.0 كان LNP الفارغ 41%، وعند pH 7.4 صار 77%. أي إنّه يزداد. وقد قرأ المؤلفون في هذا آليةَ التركيب.

والمفتاح معرفة سابقة مفادها أنّ الدهن المرتبط بـPEG هو ما يحدّد الحدّ الأعلى لحجم الجسيم. فلـPEG مساحة يشغلها على السطح، فإذا بقيت كمّيات الدهون الأخرى ثابتة، لم يكن أمام ارتفاع نسبة PEG إلا رفع نسبة المساحة السطحية إلى الحجم، أي تصغير الجسيم. وبالفعل، عند زيادة DMG-PEG من 0.25% إلى 3%، تقلّص متوسط قطر الجسيم عند pH 7.4 من 210 nm إلى 100 nm. أمّا عند pH 4.0 فلم يتغيّر القطر ولا الحمولة بتغيير كمّية PEG. أي إنّ التغيّر كلّه يحدث أثناء الديلزة.

👦 طالب: أليست الديلزة مجرّد عملية لإخراج الإيثانول؟

🧬 إكسوتارو: هنا المَزلق. فعندما يرتفع الأس الهيدروجيني في الديلزة من 4.0 إلى 7.4، يفقد الدهن المتأيّن شحنته الموجبة. فالجسيم الذي كان مستقرًّا عند pH 4.0 بـ«تنافر الشحنات + PEG» يجب أن يُستقَرّ عند pH 7.4 بـPEG وحده. وبما أنّ طريقة الإسناد تغيّرت، فإنّ الجسيم يعيد ترتيب هيئته. ويُضاف إلى ذلك أنّه لا بدّ في هذه اللحظة من الانتقال من حويصلة ذات طبقة دهنية ثنائية عند pH 4.0 إلى بنية «طبقة واحدة تُغلّف لبًّا كارهًا للماء» عند pH 7.4. وهذا يستلزم مساحة سطحية أوسع بكمّية الدهون نفسها. ولذلك فالأرجح أنّ الجسيم ينشقّ — هذا هو خطّ قراءة الورقة (وقد نصّت الورقة نفسها على أنّ سرد الشكلين 4 و6 «فرضية»، hypothesized).

والخطّ الذي تعرضه الورقة كالتالي. وكلّ ما يلي فرضية أقامتها الورقة كاستنتاج من إحصاءات المجموع، وليس رصدًا للحظة الانشقاق أو لحظة الاندماج.

عندما يكون PEG كثيرًا (1.5% أو أكثر): فـLNP الفارغ يُرجَّح أنّه انشقّ فزاد عدده (من واقعتَي الرصد: انخفاض متوسط TMR وارتفاع التركيز العددي). وفُسِّر الأمر بأنّ جزءًا من المعقّد المُحبّ للدهون، الذي كانت حمولته الأوّلية كبيرة، قد انشقّ هو أيضًا فانخفضت حمولته. أمّا متوسّطةُ الحمولة ومنخفضتها فتحافظ على حمولتها. وإذا كان PEG كثيرًا جدًّا (3.0% أو أكثر) غلب الانشقاق، فانخفض متوسط الحمولة وزاد عدد الجسيمات. وفي المقابل، استُنتج أنّ المعقّد غير المُحبّ للدهون، الذي لم يكن يحمل دهنًا مساعدًا، قد اندمج مع LNP الفارغ فتلقّى منه الدهن المساعد (وهو استنتاج عكسي من كون توزيع الحمولة يتقارب نسبيًّا بعد الديلزة، ومن كون المجموعة التي لم تكن تحمل TMR قد اكتسبته).

وعندما يكون PEG قليلًا (1.0% أو أقل): يتراخى الحدّ الأعلى للحجم، فترى الورقة أنّ المعقّدات المُحبّة للدهون تستطيع الاندماج بعضها ببعض. وكانت النتيجة زيادة كبيرة في الحمولة. وفي هذه الحالة كان ارتفاع إشارة TMR أكبر باستمرار من ارتفاع حمولة mRNA — وهذا دليل على أنّ الدهون تُؤخذ من LNP الفارغ.

والمقابلة في البيانات الفعلية واضحة. فعند PEG 1.5% انتقلت نسبة الفارغ من 41% إلى 77%، وعند PEG 0.5% من 33% إلى 81%. وفي الحالتين تزيد الجسيمات الفارغة بعد الديلزة.

③ خفض نسبة N/P يزيد الحمولة مع بقاء الحجم نفسه

والمتغيّر التشغيلي التالي هو نسبة N/P. نُبقي تركيز mRNA ثابتًا، ونزيد أو نُنقص جميع الدهون تناسبيًّا مع الدهن المتأيّن. ونسبة PEG إلى مجموع الدهون لا تتغيّر، فلا يتغيّر الحدّ الأعلى لحجم الجسيم كذلك.

ومع ذلك، ومع بقاء الحجم نفسه، زادت الحمولة في الجسيم الواحد عند خفض نسبة N/P. والسبب نسبة المخزون. فانخفاض نسبة N/P يعني أنّ الدهون صارت أقلّ نسبيًّا إزاء mRNA، أي أنّ الدهون التي ستصير LNP فارغًا تقلّ. وبالفعل، أظهرت نسبة LNP الفارغ عند pH 4.0 ارتباطًا موجبًا قويًّا بنسبة N/P (50% عند N/P = 12، و15% عند N/P = 2).

وحينها يتغيّر مَن يلتقي بمَن أثناء الديلزة، هذا هو تفسير الورقة. فإذا كانت نسبة N/P عالية، كان ما حول الجسيم جسيمات فارغة في الأغلب، فيندمج الجسيم الحامل لـmRNA مع LNP فارغ (أي يأخذ دهنًا فقط بلا زيادة في mRNA) فيبلغ الحجم الأعلى. وإذا كانت نسبة N/P منخفضة، كان ما حوله معقّدات mRNA، فـتندمج الجسيمات الحاملة لـmRNA بعضها ببعض. وكلّ ذلك ليس رصدًا، بل خطّ سرد مستنبط من التوزيعات. فعدد الشحنات المحمولة يختلف قبل بلوغ الحجم الأعلى نفسه.

لكن نسبة الجسيمات الفارغة عند pH 7.4 لم تنخفض بخفض نسبة N/P. فعند نسب N/P المنخفضة ينقص العدد المطلق لـLNP الفارغ أيضًا، لكن عدد LNP الحامل لـmRNA ينقص كذلك لأنّ الحمولة زادت. فيتعادل الأثران ولا تتحرّك النسبة، هذا هو التفسير.

④ التركيز لا يؤثّر، والحجم يؤثّر — «الحمولة ليست عددًا بل وزنًا»

عند تغيير تركيز mRNA 20 ضعفًا، من 5 إلى 100 µg/mL، مع زيادة الدهون تناسبيًّا، لم يتغيّر قطر الجسيم ولا توزيع الحمولة تغيّرًا يُذكر (ولم يَشذّ إلا أنّ نسبة الجسيمات الفارغة كانت أدنى ما يمكن عند أقلّ تركيز، 5 µg/mL، وكانت متقاربة بين 20 و100 µg/mL).

وهذا يخالف ما هو مستقرّ في عالم البوليمرات. فمن المعروف في معقّدات pDNA مع البولي إيثيلين إيمين أنّ رفع تركيز الحمض النووي يؤدّي إلى تجمّد ديناميكي في الجسيمات ذات الحمولة الكبيرة. ويفسّر المؤلفون ذلك بأنّ الدهون الموجبة الشحنة أسرع حركةً من الكاتيونات البوليمرية، فتستطيع الوصول إلى mRNA وصولًا كافيًا، ويصعب عليها أن تجسر بين عدّة جزيئات mRNA.

وفي المقابل، كان المؤثّر هو طول mRNA. فباستبدال 1929 nt بـ996 nt (أي النصف تقريبًا)، لم يتغيّر الحدّ الأعلى للحجم، لكن زاد متوسط الحمولة زيادة ذات دلالة، وبلغت القيمة الأكثر تكرارًا 2 أضعاف ما كانت عند pH 4.0 وpH 7.4 كلتيهما. وانخفضت نسبة الجسيمات الفارغة كذلك عند N/P = 3 وN/P = 6 على السواء.

🧬 إكسوتارو: والجملة التي تخرج من هنا هي أجمل خلاصة في هذه الورقة: «سعة حمولة LNP ذي حدّ أعلى معيّن للحجم لا تُعبَّر عنها بعدد جزيئات mRNA، بل بكتلة محدّدة بعينها». فبما أنّ حجم صندوق الشحن ثابت، فإنّ الشحنات الصغيرة يمكن تحميل عدد أكبر منها. ومن المنطق نفسه يتّصل تقريرٌ آخر عن دراسة حمّلت siRNA (نحو 20 nt) فوجدت أنّ LNP الفارغ لم يكن موجودًا.

⑤ إضافة جسيمات فارغة خفّضت التعبير في الكبد

وأخيرًا نتحقّق من أنّ لهذا الحديث معنى داخل الجسم. فإلى جانب صيغتَي N/P = 3 وN/P = 6 (ونسبة الفارغ في كلتيهما نحو 75% بحسب وصف الورقة. وهي تختلف قليلًا عن قيمة الصيغة المرجعية في الجدول 2، 77% ± 8%، لكنّ الرقمين كليهما من الورقة نفسها)، أُعِدّت مجموعة N/P = 3+3، وهي LNP محضَّر عند N/P = 3 خُلط به لاحقًا LNP فارغ حتى بلغت نسبة N/P الكلّية 6 (ونسبة الفارغ 86%). وهي مجموعة لم يتغيّر فيها عدد LNP الحامل لـmRNA، بل تضاعفت فيها الجسيمات الفارغة نحو مرّتين فقط.

وبتحميل mRNA اللوسيفيراز، أُعطي 0.5 mg mRNA/kg عبر الوريد الذيلي لفئران Balb/cJ (أنثى، بعمر 8 أسابيع)، وبعد 12 ساعة أُعطي D-لوسيفيرين داخل الجَوف البريتوني وصُوِّر بجهاز IVIS، ثم استُخرجت الأعضاء وقُيِّست كمّيًّا.

• الكبد: انخفض التعبير في المجموعة التي أُضيف إليها LNP فارغ (N/P = 3+3) (P = 0.0298، اختبار t غير مزدوج ثنائي الطرف، بمقارنة N/P = 3 بـN/P = 3+3). أمّا مقدار التوزّع إلى الكبد نفسه فلم يتغيّر
• الطحال: لم تُظهر تعبيرًا ذا معنى إلا المجموعتان المشتقّتان من N/P = 3 (أي 3 و3+3)، ولم يكن هناك تعبير يُذكر عند N/P = 6 (P = 0.0280)

ويُقال إنّ تجمّع LNP في الكبد يعود إلى تفاعله مع أبوليبوبروتين E (ApoE) في الدم. وقد طرح المؤلفون احتمال أنّ LNP الفارغ قد نازع LNP الحامل لـmRNA على ApoE، لكنّهم ختموا بحذر بعبارة «يحتاج الأمر إلى مزيد من الدرس».

كيف سيتغيّر المستقبل؟ (الطريق إلى العيادة)

يمكن إدخال «مؤشّر من جهة الجسيم» في ضبط جودة التصنيع

وهذا أكثر الاستخدامات واقعية. فبما أنّ CICS يقيس داخل التدفّق، فإنّ كمّية العيّنة المطلوبة ضئيلة، ويستطيع معالجة أكثر من 50,000 حدث في 20 دقيقة لكلّ صيغة (والأحداث تشمل أنواعًا أخرى، مثل mRNA العاري). وقد طبّقت الورقة ذلك على تقييم ثبات التخزين كذلك (الشكل التكميلي 12).

وما يُستخدم اليوم في الحكم على دفعات مستحضرات LNP هو: قطر الجسيم، ومعامل تعدّد التشتّت، وجهد زيتا، وكفاءة التغليف. فماذا يحدث إذا أُضيف إليها مؤشّرا نسبة الجسيمات الفارغة وتوزيع الحمولة في الجسيم الواحد؟ إنّ دفعتين لهما كفاءة التغليف نفسها 94%، إحداهما نسبة الفارغ فيها 77% والأخرى 50%، يختلف فيهما مجموع الدهون المنقولة عند إعطاء الكمّية نفسها من mRNA. أي إنّه يصبح ممكنًا ضبط حِمل الدهون اللازم لإحداث الأثر نفسه، باعتباره مؤشّرًا.

ظهر اتّجاه للتحسين اسمه «تقليل الجسيمات الفارغة»

رتّبت هذه الورقة أيَّ مِقبض يُدار وأيَّ شيء يتحرّك عند إدارته. فكمّية PEG تحدّد الحدّ الأعلى لحجم الجسيم، ونسبة الكتلة بين الدهون وmRNA تحدّد التنازع الأوّلي بين معقّد mRNA المتكوّن وLNP الفارغ، ثم يُكمل الانشقاق والاندماج أثناء الديلزة الصورةَ النهائية. والتركيز لا يؤثّر. وإذا صغرت الحمولة قلّت الجسيمات الفارغة.

👦 طالب: فلنصنع إذن LNP بلا جسيمات فارغة على الإطلاق.

🧬 إكسوتارو: والطرافة أنّ الأمر ليس بهذه البساطة. فمحاولة تقليل الجسيمات الفارغة بخفض نسبة N/P تزيد الحمولة في الجسيم الواحد وتُنقص عدد الجسيمات. وفي تجربة الحيوان في هذه الورقة، لم يُعطِ N/P = 6 تعبيرًا يُذكر في الطحال، أمّا N/P = 3 فأعطى تعبيرًا. أي إنّ قليلًا من الجسيمات ذات الحمولة الكبيرة، وكثيرًا من الجسيمات ذات الحمولة الصغيرة، يسلكان في الجسم سلوكًا مختلفًا حتى عند تساوي مجموع mRNA. فالحلّ الأمثل يتغيّر بحسب الجهة التي نريد التوصيل إليها. وينبغي أن تُقرأ نسبة الجسيمات الفارغة لا كـ«شرّ يجب تصغيره»، بل كواحدة من درجات حرّية التصميم.

وفي المقابل، فالمسافة إلى العيادة كبيرة بصراحة

لا توجد في هذه الورقة بيانات سريرية. وتجربة الفئران كذلك إعطاء مفرد، ونقطة زمنية واحدة عند 12 ساعة، والكبد والطحال وحدهما، وجين مُبلِّغ. أمّا الإعطاء المتكرّر، والاستجابة المناعية، وتعبير بروتين علاجي، والحركية الدوائية في الإنسان، فكلّها خارج النطاق. وكما سنكتب في البند التالي، فإنّ الصيغة التي قِيست ليست صيغة اللقاحات المتداولة.

كيف نقرأ هذا البحث قراءة نقدية؟ (الحدود، وطريق الارتقاء بالجودة)

ما يُحسب لها

أكتب بإنصاف. إنّ تصميم القياس صحيح. ففكرة تغطية المقطع العرضي بصفيحة ضوء لتوحيد كفاءة الكشف، وتصميم التفريق بين ثلاثة أنواع بالتوهّج المتزامن لثلاثة ألوان، وكذلك منهج القياس العملي لتوزيع جزيئة mRNA عارية واحدة واستخدامه أساسًا، كلّها تتّجه نحو «تعداد بلا تمويه». وبقياس ما قبل الديلزة وما بعدها كليهما تحوّل الوصف الساكن إلى حديث عن آلية. وقد قدّروا بأنفسهم كمّيًّا أنّ التفريق بلونين قد يُخطئ تصنيف ما يصل إلى 10.4% من الأحداث، وهي أمانة تُذكر. وقد تحقّقوا من النتيجة بطريقة متعامدة: فقد رصدوا جسيمات LNP مثبّتة في راتنج بمجهر متحد البؤرة فائق التحليل، فأكّدوا كثرة الجسيمات الفارغة عبر مسار مستقلّ. والشيفرة البرمجية متاحة عند الطلب، وأُرفقت بيانات المصدر كذلك. فالموقف تجاه قابلية الاستنساخ جيّد.

ما ينبغي الحذر منه عند القراءة

① هذا ليس قياسًا للقاحات mRNA المتداولة. وأضع هذه النقطة أولًا لأنّها أكثر ما يُساء فهمه. فالدهن المتأيّن المستخدم هو DLin-MC3-DMA (وهو الدهن الذي دخل حيّز الاستخدام في دواء patisiran الـsiRNA)، وليس ALC-0315 (في BNT162b2) ولا SM-102 (في mRNA-1273) المستخدمَين في لقاحات كوفيد-19. وأمّا mRNA فهو mRNA تجاري موسوم بصبغة استُبدل فيه 25% من اليوريدين بنظير موسوم بـCy5، وهو شيء آخر غير mRNA المعدَّل بـN1-ميثيل بسودويوريدين المستخدم في اللقاحات. والديلزة أيضًا دفعة مختبرية مدّتها 12 ساعة، وهي تختلف عن الترشيح بالتدفّق المماسّي الصناعي. فتلخيص الأمر بعبارة «80% من اللقاح جسيمات فارغة» قراءة خاطئة لهذه الورقة.

② لم يُقدَّم ضمان لخطّية التوهّج. ففكّ الالتفاف يتوقّف توقّفًا كاملًا على افتراض أنّ «سطوع الجسيم الذي يحمل n يساوي n أضعاف توزيع الواحدة». لكنّ الصبغات تُخمد ذاتيًّا عند تزاحمها، ويحدث انتقال للطاقة إذا تقاربت المسافات. ولم تتحقّق الورقة مما إذا كان Cy5 يتوهّج فعلًا n أضعاف وهو في حالة عدّة جزيئات mRNA محشورة في لبّ دهني. فإذا وُجد إخماد، فإنّ الحمولة تكون مقدَّرة بأقلّ من حقيقتها. ولو كان هناك شاهد غُلِّفت فيه كمّية معلومة من mRNA، أو تجربة تفحص وجود الإخماد من عدمه، لاشتدّ هذا الافتراض كثيرًا.

③ وحدة التركيز العددي للجسيمات لا تتّسق. ففي الجدول 2 كُتب التركيز العددي لـLNP الحامل لـmRNA هكذا: 1.29 × 10¹⁶ ± 2.22 × 10¹⁵ mL⁻¹. لكن بالتقدير من كمّية mRNA المُدخلة: mRNA بتركيز 20 µg/mL وطول 1929 nt (وزن جزيئي نحو 6.4 × 10⁵) يعطي نحو 1.9 × 10¹³ جزيئة/mL، فإذا كانت كفاءة التغليف 85.6% والحمولة 2.80 في الجسيم، كان الناتج نحو 6 × 10¹² جسيم/mL. فالقيمة المكتوبة أكبر بنحو 2,000 ضعف. وحتى لو افترضنا أنّ الوحدة L⁻¹، لبقي فرق نحو 2.2 ضعف، ولذلك لا يمكن الجزم بأنّ الأمر خطأ مطبعي في الوحدة. وتفاصيل الحساب في المواد التكميلية (Supplementary Discussion 2–5) ولا يمكن تتبّعها في النصّ الرئيسي، فلا أجزم بشيء؛ لكن من يقتبس الرقم من النصّ الرئيسي وحده سيُخطئ في رتبة المقدار. أمّا النسبة بين الفارغ والحامل لـmRNA (4.88 × 10¹⁶ مقابل 1.29 × 10¹⁶ ≈ 79% مقابل 21%) فهي متّسقة مع 77% و23%، أي إنّه لا إشكال في قراءتها كنسبة.

④ في النصّ جملة متناقضة. فمباشرةً بعد البرهنة على ضرورة التفريق بثلاثة ألوان، كُتب: «ولذلك استُخدمت طريقة التفريق بلونين في حساب توزيع الحمولة والسعة، للحصول على دقّة أعلى». والقراءة الطبيعية من السياق أنّها خطأ مطبعي عن «استُخدم التفريق بثلاثة ألوان»، لكنّ تعذّر الجزم من النصّ بأيّ الطريقتين خرجت النتائج الرئيسية أمر مؤلم في ورقة بضاعتها التعداد. وبالمثل، يتعارض طول موجة الليزر بين بند النتائج 647 nm وبند الطرائق 640 nm (ومن اسم المنتج يتبيّن أنّ 640 nm هي الصحيحة). كذلك يشير شرح الشكل 7 إلى نتيجة الكبد بأنّها «اللوحة i» مع أنّها في الأصل اللوحة l. ولا شيء من ذلك يقلب النتائج، لكنّها عيوب كان يمكن إزالتها بالتصحيح اللغوي.

⑤ تسمية «قبل الديلزة» تتعارض مع بند الطرائق. وأعيد ذكر النقطة التي أشرت إليها أعلاه، بوصفها حدًّا من حدود الورقة. فالجدول 2 يسمّي عيّنة pH 4.0 «قبل الديلزة = جسيم LNP الأوّلي»، في حين ينصّ بند الطرائق على أنّ عيّنة pH 4.0 قد خضعت هي أيضًا للديلزة 12 ساعة (مقابل محلول أسيتات منظّم، لإخراج الإيثانول). فما تجري مقارنته ليس وجود الديلزة من عدمه، بل الأس الهيدروجيني الذي تُجرى الديلزة نحوه. ولا يتأثّر ادّعاء الورقة — أنّ ارتفاع الأس الهيدروجيني ونزع البروتونات يُعيدان ترتيب الجسيم — بهذا التصحيح، لكن من يأخذ عبارة «قبل الديلزة» بحرفيّتها سيُسيء الفهم فيحسب أنّ القياس جرى على جسيمات بقي فيها الإيثانول. وكان ينبغي توحيد الألفاظ بين الجدول وبند الطرائق.

⑥ «الآلية» فرضية في معظمها. فخطّ الانشقاق والاندماج في الشكلين 4 و6 هو — كما تكتب الورقة نفسها hypothesized وpresumably — استنتاج من إحصاءات المجموع: النسب، والمتوسط الهندسي لـTMR، والتركيز العددي. ولم يُرصد بتحليل زمني لحظةُ انشقاق جسيم بعينه أو اندماجه. وهناك سند بأنّ ذلك يتّسق مع تقارير سابقة في FRET والمجهر الإلكتروني بالتبريد، لكن تبقى قائمةً المسافة بين «لا بدّ أنّ الأمر كذلك» وبين «الأمر كذلك» فعلًا.

⑦ العيّنة n صغيرة، والاستنتاجات النافية ضعيفة بسببها. فمعظم الشروط عند n = 3 (والصيغة المرجعية وحدها عند n = 6). ولإجراء ادّعاء بعدم وجود فرق — مثل «التركيز لا يؤثّر في الحمولة» و«حجم mRNA لا يؤثّر في الحدّ الأعلى للحجم» — عند n = 3، كنّا نودّ أن نرى تصميم تكافؤ وذكرًا للقدرة الإحصائية.

⑧ القيمتان المختلفتان لكفاءة التغليف لم يُجسَر بينهما. فالفرق البالغ نحو 9 نقاط بين 94.2% بطريقة RiboGreen و85.6% بـCICS تعرضه الورقة جنبًا إلى جنب دون أن تناقش سببه. وأيّهما أقرب إلى الحقيقة، وهل يعود الفرق إلى كفاءة الكشف أم إلى وصول الصبغة — هذا متّصل بموثوقية التعداد نفسها.

⑨ في تفسير تجربة الحيوان مُخالَطة. فمجموعة N/P = 3+3 مجموعة أُضيف إليها LNP فارغ. أي إنّ مجموع الدهون المُعطاة قد زاد هو أيضًا. وإذا أُريد تفسير انخفاض التعبير في الكبد بالتنازع على ApoE، فلا بدّ من شاهد مُوحَّد في مجموع الدهون (مثل مجموعة يُضاف إليها، بدلًا من LNP الفارغ، قدر مماثل من ليبوزومات غير ذات صلة). وتجنّبُ المؤلفين الجزمَ أمر سليم، لكن قراءة الأمر على أنّ «الجسيمات الفارغة تعترض الطريق» لا تثبت بهذه البيانات وحدها. ويُضاف إلى ذلك n = 3 إلى 4، ونقطة زمنية واحدة عند 12 ساعة، والأُنثى وحدها، وسلالة واحدة وحدها.

⑩ ما يُقاس هو الحالة بعد التخفيف وبعد ترك العيّنة أكثر من ساعة. فـCICS يُخفّف العيّنة ويحضنها مع YOYO-1 في الظلام أكثر من ساعة، ثم يقيسها في 20 دقيقة. وبما أنّ LNP ليس بنيةً صلبةً في حالة توازن، فإنّ ما نودّ التحقّق منه أصلًا هو ما إذا كانت الحالة قد تحرّكت أثناء المعالجة القبلية للقياس (وقياسهم لثبات التخزين علامة طيّبة، لكنّه ليس تحقّقًا من المعالجة القبلية نفسها).

⑪ لم يُوصَل بين الحمولة والوظيفة. فحتى لو عرفنا «كم في الجسيم الواحد»، فإنّ كيفية ارتباط ذلك بالإفلات من الجسيم الداخلي وبمقدار الترجمة لم تُقَس. فكم مرّة يختلف إنتاج البروتين عند دخول جسيم واحد إلى الخلية بين جسيم يحمل 2 وجسيم يحمل 8؟ وبسدّ هذه الفجوة وحدها تكتمل نسبة الجسيمات الفارغة كمؤشّر تصميمي.

كيف كان يمكن أن يصير البحث أرفع جودة؟

• إدخال تحقّق من الإخماد. بالتأكّد من الخطّية بجسيمات معيارية غُلّفت فيها نسخ معلومة العدد من mRNA، أو بـmRNA متغيّر معدّل الوسم بـCy5. فبذلك يثبت أساس فكّ الالتفاف
• إجراء القياس نفسه على صيغ اللقاحات المتداولة ALC-0315 وSM-102. فهذه أكبر جهة استقراء لهذا البحث، وهي الرقم الذي يريد القارئ معرفته أكثر من غيره
• المطابقة الآلية بين الأرقام والوحدات. فوحدة التركيز العددي للجسيمات، ووصف اللونين مقابل الألوان الثلاثة، وطول موجة الليزر، ومراجع الأشكال — كلّها يمكن إزالتها بقائمة تحقّق قبل الإرسال
• رصد الآلية رصدًا مباشرًا. بالتدفّق المتوقّف مع FRET المحلول زمنيًّا، أو بقناة ميكروية تتيح تتبّع مسار الديلزة، لالتقاط الانشقاق والاندماج في الزمن الحقيقي
• توحيد مجموع الدهون في تجربة الحيوان. فإن أُريد ادّعاء أثر LNP الفارغ، فلا بدّ من مجموعة شاهدة مُوحَّدة في كمّية الدهون. ومعها تتبّع زمني بعد الإعطاء وأعضاء متعدّدة
• الوصل بين الحمولة ومقدار التعبير على مستوى الخلية الواحدة. بتحضير جسيمات مفروزة بحمولات موحّدة، وقياس عدد الجسيمات المبتلعة وإنتاج البروتين في الوقت نفسه

وجهة نظر إكسوتارو

المؤلف المسؤول يبحث في المرض نفسه الذي أبحث فيه

أقولها بصراحة. إنّ الكيمياء الفيزيائية لمستحضرات mRNA-LNP ليست تخصّصي بعينه. فما أعمل عليه هو علاج أمراض الجهاز العصبي، وفي صدارتها إصابة الحبل الشوكي، باستخدام الخلايا الجذعية الوسيطة (mesenchymal stem cell, MSC) والحويصلات خارج الخلوية (extracellular vesicle, EV) الخارجة منها.

ومع ذلك، فأحد أسباب اختياري هذه الورقة أنّ مختبر المؤلف المسؤول Mao يُجري فعليًّا طبًّا تجديديًّا لإصابة الحبل الشوكي. وكما ذكرت آنفًا: حقن المركّب النانوي الليفي الهيدروجيلي في رضّ الحبل الشوكي في الجرذ في Biomaterials 2020، ثم علاج إصابة الحبل الشوكي بالجمع بين MSC وذلك المركّب في Cells 2022. فبحثُ عدّ الجسيمات النانوية واحدًا واحدًا، وبحثُ إيصال MSC إلى الحبل الشوكي المصاب، تحت سقف واحد. ولا أظنّ ذلك محض مصادفة. فكلاهما طرفان لسؤال واحد بعينه: إلى أيّ حدّ نعرف ما في جوف عربة النقل.

أثقل الدروس — نحن نتحدّث بالمتوسّطات أكثر من اللازم

وما وضعته هذه الورقة أمامي لم يكن الطريقة ولا الأرقام، بل طريقة طرح السؤال.

تذكّروا الأرقام التي نكتبها في أوراق EV. بتحليل تتبّع الجسيمات النانوية: «كم جسيمًا في المليلتر الواحد». وفي أنبوب اختبار آخر نستخلص RNA فنقول: «كم ng من RNA»، أو «كم نسخة من هذه الـmiRNA». ثم نُجري قسمة فنقول: «كم نسخة في الجسيم الواحد».

وهذا بالضبط هو «متوسط الحمولة الإجمالي» الذي أظهرت هذه الورقة أنّ المتوسط لا يُبيّنه. متوسطٌ هو حاصل قسمة مجموع كمّية المجموعة على عدد المجموعة. وهو لا يجيب عن السؤال: «في أيّ جسيم، وكم فيه». (وللاحتياط — وهو شيء آخر غير كفاءة التغليف. فكفاءة التغليف نسبة من جهة mRNA تقول «كم حصّة ممّا أُدخل في التحضير قد غُلّف»، وليست عددًا لكلّ جسيم مستخرجًا بقسمة. فما هدمته هذه الورقة هو «الحديث بالمتوسّطات».)

وقد سبق في ميدان EV تحذير. فقد حلّل Chevillet وزملاؤه في PNAS 2014، المجلد 111، العدد 41، الصفحة 14888 محتوى الإكسوسومات من الميكرو آر إن إيه (miRNA) تحليلًا كمّيًّا وستويكيومتريًّا، وأفادوا بأنّ معظم الإكسوسومات الفردية لا تنقل عددًا ذا معنى حيوي من miRNA. وبالنسبة إلى miRNA معيّنة يقلّ متوسطها في الجسيم الواحد عن 0.01 نسخة، فإنّ ما يعنيه «متوسط 0.01 نسخة» ليس «في كلّ جسيم 0.01»، بل «الغالبية العظمى من الجسيمات فارغة اليدين، وقليل جدًّا منها وحده يحمل نسخة واحدة أو أكثر» (وبما أنّ شكل التوزيع لا يتحدّد من المتوسط وحده، فلا يصحّ الجزم بأنّ «جسيمًا واحدًا من كلّ 100 جسيم يحمل نسخة واحدة بالضبط»). والبنية هي نفسها بنية كون 77% من LNP فارغة الحمولة.

وأكتبها مراجعةً لنفسي. عندما أنسُب الأثر العلاجي لـMSC-EV إلى miRNA بعينها، فإنّني لم أقِس كم في المئة من الجسيمات تحمل تلك الـmiRNA فعلًا. فما فعله مؤلفو هذه الورقة في جسيمات اصطناعية، لم نستطع نحن بعد أن نفعله في جسيمات ذات منشأ حيوي.

لكنّ الأرقام لا تُنقل — ما يُنقل هو السؤال وحده

وأكتب هنا بحذر. فـLNP وEV شيئان مختلفان. فـLNP جسيم اصطناعي يُصمَّم ويُركَّب، تركيبه معلوم، وتوزيع حجمه قابل للضبط. أمّا EV فالكائن الحيّ يصنعه، فكلّ جسيم يختلف عن الآخر، وفي غشائه بروتينات غشائية مثل التيتراسبانين، وسطحه مغطّى بطبقة من البروتين. فلا يوجد في أيّ مكان سند يجعل رقم «77% فارغة» منطبقًا على EV.

وما يُنقل هو السؤال والمنهجية. والمنهجية في الحقيقة أقرب مما يُتوقّع. فـCICS تقنية «تُسيل العيّنة في صفّ واحد داخل شعيرة، وتُصنّف بالتوهّج المتزامن لعدّة ألوان، وتُقدّر العدد باتّخاذ توزيع الجزيئة الواحدة المعلوم أساسًا». وتحليل الحويصلة الواحدة (single-EV analysis) الذي يتوسّع اليوم في ميدان EV، وقياس التدفّق الخلوي عالي الحساسية الذي يستخدم القنوات الميكروية، يسيران في الاتّجاه نفسه بالفكرة نفسها.

👦 طالب: فلنفعل إذن الشيء نفسه في EV.

🧬 إكسوتارو: ينبغي ذلك، وأنا أريده. لكن أُضيف عتابًا على النفس تعلّمته من هذه الورقة. فأقوى ما استطاعت هذه الورقة ادّعاءه إنّما جاء من قياس ما قبل الديلزة وما بعدها كليهما. ولو كانوا قاسوا المنتج النهائي وحده، لانتهى الأمر عند واقعة «80% فارغة» ولما بلغوا «لماذا صار كذلك». والأمر نفسه في EV: فإن اقتصرنا على قياس المنتج النهائي المجموع من رواشح الزرع، فلن نعرف أبدًا لماذا صار التوزيع على ما صار عليه. فمرحلة تحميل الخلية لـEV، ومرحلة الإطلاق، ومرحلة الجمع والتنقية — لا بدّ من قياس كلّ مرحلة على حدة لمعرفة أين يتحدّد ماذا. ونحن اليوم نقيس المنتج النهائي وحده تقريبًا.

المسافة إلى جهة الوصول لم تُسَدّ بعد

وأخيرًا، كمسألة تخصّني. فما أظهرته تجربة الحيوان في هذه الورقة هو التوصيل إلى الكبد والطحال. وهما أيسر الأعضاء وصولًا للجسيمات النانوية المحقونة وريديًّا، وهي تركب فوق ذلك آلية معلومة هي ApoE. أمّا ما أريد التوصيل إليه فهو نسيج عصبي مصاب يقع وراء الحائل الدموي الدماغي والحائل الدموي النخاعي.

وأن نستطيع عدّ ما في جوف الجسيم عدًّا دقيقًا، وأن يصل ذلك الجسيم، مسألتان مختلفتان. ومع ذلك، فالترتيب هو أنّ ما لا يُعَدّ لا يمكن تحسينه. وبخروج رقم «2 في الجسيم الواحد»، صار النقاش في «كم جسيمًا نحتاج إذن؟» و«أيّ قدر من الدهون سنُحمّله؟» حسابًا لا تخمينًا.

وأنا أثق بأسلوب كتابة هذه الورقة نفسه. فقد كتبوا «hypothesized» و«presumably» في شرح آليتهم، وكتبوا في تفسير تجربة الحيوان أنّه يحتاج إلى مزيد من الدرس. فهم لا يخلطون ما قاسوه بما خمّنوه. موقف متواضع، لكنّني أراه لائقًا بورقة بضاعتها التعداد.

وهذا المقال قرينٌ لمقال نُشر في اليوم نفسه: «مُعزِّز» لقاح mRNA لم يكن المحتوى، بل الوعاء. فهذا المقال يتحدّث عن أنّ «أغلب LNP فارغة الحمولة»، وذاك يتحدّث عن أنّ «تلك الجسيمات الفارغة نفسها هي ما يُحرّض المناعة الفطرية». وقراءتهما معًا تزيد الأمر طرافةً بدرجة.

ملاحظة: كُتب هذا المقال بمساعدة الذكاء الاصطناعي.