Contamos una a una las nanopartículas lipídicas que transportan ARNm: llevaban 2.8 moléculas de media y ocho de cada diez partículas circulaban «de vacío»

Las nanopartículas lipídicas (lipid nanoparticle, LNP) son transportistas que envuelven un ARNm frágil en un grano de lípidos y lo llevan hasta el interior de la célula. Las vacunas de ARNm las pusieron en uso de golpe y hoy se emplean también en tratamientos que llevan al hígado herramientas de edición genética.

Hagamos aquí una pregunta ingenua. ¿Cuántas moléculas de ARNm hay dentro de una sola de esas partículas?

Casi nadie sabía responder de inmediato. Lo que aparece en la ficha de calidad de una formulación es una cifra del tipo «eficiencia de encapsulación (encapsulation efficiency, EE) 94%». Significa «del ARNm que se puso, un 94% quedó dentro de las partículas», es decir, una proporción vista desde el lado del ARNm. A las preguntas que se hacen desde el lado de la partícula —cuántas moléculas lleva cada una, cuántas partículas van con las manos vacías— no responde ni una palabra.

El trabajo que traemos hoy es un artículo de 2022 de Nature Communications que respondió a esa pregunta partícula por partícula. Escribo antes la conclusión. En las LNP de una formulación experimental estándar, la media por partícula entre las partículas que llevan ARNm es de 2.80 moléculas y la moda es de 2 moléculas. Y del total de partículas, el 77% no llevaba ni una sola molécula de ARNm.

Dos advertencias antes de empezar. La primera: es un artículo de 2022. Lo traemos de todos modos porque, a mi juicio, la cifra que salió de aquí —«la mayoría va de vacío»— se convirtió en el punto de partida para pensar este campo de ahí en adelante, y porque su manera de medir encaja directamente con nuestra investigación en vesículas extracelulares (extracellular vesicle, EV). La segunda: lo que se midió fue un ARNm comercial marcado con colorante y una formulación experimental «de libro de texto» que usa DLin-MC3-DMA como lípido ionizable. No es un artículo que midiera la vacuna contra la COVID-19 en sí. No confundan estas dos cosas.

Datos de la publicación

• Título del artículo: Payload distribution and capacity of mRNA lipid nanoparticles (Distribución y capacidad de carga de las nanopartículas lipídicas de ARNm)
• Tipo de artículo: artículo original (desarrollo de técnica de medición y fisicoquímica de la formulación)
• Revista: Nature Communications 2022, volumen 13, número de artículo 5561 (recibido el 13 de enero de 2022, aceptado el 5 de septiembre, publicado en línea el 23 de septiembre)
• DOI / enlace: 10.1038/s41467-022-33157-4
• Licencia: acceso abierto (CC BY 4.0). Cualquiera puede leer el texto completo
• Impact Factor: en torno a 15 de forma aproximada (varía según el año; es una de las revistas científicas generalistas de más alto nivel)
• Autores: Sixuan Li y Yizong Hu (ambos primeros autores conjuntos), Andrew Li, Jinghan Lin, Kuangwen Hsieh, Zachary Schneiderman, Pengfei Zhang, Yining Zhu, Chenhu Qiu, Efrosini Kokkoli, Tza-Huei Wang y Hai-Quan Mao; doce en total
• Afiliaciones: todas en la Universidad Johns Hopkins (Baltimore, Maryland, EE. UU.). Departamento de Ingeniería Mecánica, Instituto de NanoBioTecnología (INBT), Departamento de Ingeniería Biomédica de la Facultad de Medicina, Translational Tissue Engineering Center, Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, Departamento de Ciencia e Ingeniería de Materiales
• Autores corresponsales: Yizong Hu, Tza-Huei Wang y Hai-Quan Mao; tres en total (de Wang y Mao se hace constar expresamente que «contribuyeron por igual como autores corresponsales conjuntos»)
• Financiación: las ayudas U01AI155313 (Mao) y R01AI137272 (Wang) del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas de Estados Unidos (NIAID)
• Declaración de conflictos de interés: cuatro de los autores —Li, Hu, Wang y Mao— tienen en trámite una solicitud de patente sobre la tecnología de este artículo (a través de la Office of Technology Ventures de la Universidad Johns Hopkins). Los demás autores no declaran nada
• Revisión por pares: por la política de Nature Communications los informes de revisión son públicos, y entre los revisores se da a conocer el nombre de Xucheng Hou

¿Qué clase de investigadores son los autores corresponsales?

Hai-Quan Mao dirige el Instituto de NanoBioTecnología (INBT) de la Universidad Johns Hopkins y es a la vez catedrático en el Departamento de Ciencia e Ingeniería de Materiales y en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Facultad de Medicina. Su trayectoria es algo peculiar: se licenció en química (1988) y se doctoró en química de polímeros (1993) en la Universidad de Wuhan (China), ejerció allí como profesor y, de 1995 a 1998, hizo un posdoctorado en la Universidad Johns Hopkins. De 1999 a 2003 fue investigador principal conjunto de Johns Hopkins Singapore, de 2001 a 2003 compatibilizó el puesto de profesor adjunto en la Universidad Nacional de Singapur y en 2003 pasó a formar parte del profesorado de la Whiting School of Engineering de la Universidad Johns Hopkins. En 2016 fue nombrado subdirector del INBT y hoy es su director. Es fellow de la Real Sociedad de Química del Reino Unido (2014), del Instituto Estadounidense de Ingeniería Médica y Biológica (AIMBE) en 2018 y fellow de la Academia Nacional de Inventores de Estados Unidos, la NAI (2023).

Su investigación tiene dos pilares. Uno es un método llamado flash nanocomplexation (FNC) que hizo escalable el proceso de mezclar ácidos nucleicos o proteínas con un polímero para convertirlos en nanopartículas. El otro es el compuesto de nanofibra e hidrogel (nanofiber-hydrogel composite, NHC), un material de andamiaje inyectable en el que fragmentos de nanofibra de policaprolactona (PCL) electrohilada se entretejen mediante enlaces covalentes en la red de gel del ácido hialurónico.

Este es un punto importante para mí, así que lo escribo ya de entrada. El laboratorio de Mao ha llevado adelante de verdad una línea de investigación que aplica ese NHC a la lesión de la médula espinal. Biomaterials 2020, volumen 245, 119978 (primera autora Xiaowei Li, último autor Mao) es un estudio que inyectó NHC en un modelo de contusión medular en rata, y en Cells 2022, volumen 11, número 7, 1137 (primera autora Agnes Haggerty, con Mao y Martin Oudega como coautores, acceso abierto) inyectaron en la médula lesionada células estromales mesenquimales derivadas de la médula ósea, mesenchymal stromal cell o MSC, combinadas con el NHC. Es decir, el autor corresponsal de este artículo es alguien que hace en un mismo laboratorio la fisicoquímica de las LNP de ARNm y la medicina regenerativa de MSC aplicada a la lesión medular. Volveremos a esto en la segunda mitad.

Tza-Huei (Jeff) Wang es el catedrático Louis M. Sardella del Departamento de Ingeniería Mecánica de la misma universidad (una cátedra dotada creada en 2021), tiene además nombramiento conjunto en el Departamento de Ingeniería Biomédica y dirige el BioMEMS and Single Molecule Dynamics Lab. Se doctoró en ingeniería mecánica en la Universidad de California en Los Ángeles (UCLA) en 2002 y ese mismo año se incorporó a la Universidad Johns Hopkins; es catedrático numerario desde julio de 2013. Es fellow de la AIMBE (2017, elegido por sus trabajos en nanobiosensores y en el análisis de enfermedades genéticas y epigenéticas mediante detección de moléculas individuales). Tiene más de 150 artículos y más de 20 patentes.

La tecnología central de este artículo es, en sí misma, una invención del laboratorio de Wang. El CICS que se emplea en el texto (cylindrical illumination confocal spectroscopy, espectroscopía confocal de iluminación cilíndrica) es un método que ese laboratorio publicó en Biophysical Journal 2008, volumen 95, página 2964. Su tema habitual va en otra dirección —detectar el cáncer de forma precoz leyendo con digital high-resolution melting la metilación de la biopsia líquida, el ADN en cantidades mínimas que circula por la sangre—, pero comparte con este análisis de LNP un punto exacto: «contar con precisión, de una en una, un número muy pequeño de moléculas».

Yizong Hu, primer autor conjunto y a la vez autor corresponsal, es, según el apartado de contribuciones de los autores, la persona que concibió este estudio. Se licenció en materiales poliméricos en la Universidad Tsinghua (2016) y se doctoró en ingeniería biomédica en la Universidad Johns Hopkins (2022). Según su perfil público, después ha investigado la entrega génica no viral como posdoctorando en el Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT).

Para empezar, ¿qué era lo que no sabíamos hasta ahora?

La pregunta que la «eficiencia de encapsulación del 94%» no responde

Lo que aparece sin falta cuando se habla de la calidad de una LNP es la eficiencia de encapsulación. Medirla es sencillo: se usa un colorante que se une a los ácidos nucleicos y emite luz, como el RiboGreen, y se compara la fluorescencia «antes de romper las partículas con un detergente» con la de «después de romperlas». Antes de romperlas solo brilla el ARNm que está fuera; después brilla todo. De esa diferencia sale «qué porcentaje estaba dentro de las partículas».

👦 Estudiante: Si entra nada menos que el 94%, tengo la sensación de que con eso basta.

🧬 Dr. Exotaro: No, es que la pregunta es otra. Esto es el recuento de los paquetes. Lo que dice es: «de los 100 paquetes que salieron, 94 se cargaron en los camiones». Pero lo que nosotros queremos saber está del lado del camión: cuántos camiones circulan, cuántos paquetes lleva cada uno y cuántos van vacíos. Con el recuento no lo sabremos nunca.

No es un juego de palabras. Si se conoce la carga por partícula, se conoce el número de partículas. Y si se conoce el número de partículas, se puede discutir cuántas partículas tiene que captar una célula para que haya efecto. Además, si hay muchas partículas vacías, resulta que se está administrando al paciente lípido que no contribuye al efecto. Como se sabe que el lípido en sí puede estimular el sistema inmunitario o cargar el hígado, esto conecta directamente con la seguridad.

¿Por qué nadie había podido medirlo?

A los métodos de medida existentes les faltaba, a todos, un paso.

La criomicroscopía electrónica (cryo-TEM) permite ver las partículas directamente. Pero al pH fisiológico de 7.4 el lípido ionizable pierde su carga y forma en el centro de la partícula un núcleo amorfo e hidrófobo, de modo que la partícula se ve igual de negra y compacta tanto si lleva ARNm como si no lo lleva. En este artículo también se fotografiaron LNP vacías preparadas sin ARNm, y no hay manera de distinguirlas.

La dispersión de neutrones de ángulo pequeño, la NMR y el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) chocan con el mismo muro. Dan el tamaño de las partículas y su estructura media, pero no permiten dictaminar partícula por partícula si hay contenido o no lo hay.

Por eso los autores eligieron la fluorescencia. Pero con un microscopio corriente no basta. Lo que hacía falta era un aparato capaz de hacer pasar las partículas de una en una, sin dejarse casi ninguna, y registrar qué colores se encendían al mismo tiempo (la expresión del artículo es «eficiencia de detección de masa de casi el 100%»).

CICS: hacer pasar las partículas de una en una por el «torniquete» de un capilar

La idea del CICS es esta. Se empuja la muestra con presión (gas argón a 42 psi) por un capilar de cuarzo de 10 µm de diámetro interno, fino como un cabello. La velocidad de flujo es de 1 mm/s. Allí se dirigen tres láseres (488 nm, 552 nm y 640 nm) reunidos en uno solo con un combinador de haces, aplicados como una «lámina de luz» estirada lateralmente por una lente cilíndrica.

👦 Estudiante: ¿Por qué una lámina y no un punto normal?

🧬 Dr. Exotaro: Para tapar el torniquete a todo lo ancho. Si se concentra el láser en un punto, solo las partículas que pasan por el centro del capilar brillan con fuerza y las que pasan por los bordes quedan oscuras. Así no se puede distinguir una «partícula oscura» de una «partícula con poco contenido». Si en cambio se cubre toda la sección con una lámina de luz, la partícula brilla igual por donde quiera que pase. El artículo lo expresa como una eficiencia de detección de masa de casi el 100%. Todos pasan por el torniquete, y además todos en las mismas condiciones.

Los detectores son tres fotodiodos de avalancha (APD) que cuentan fotones individuales. Registran en pasos de 0.1 milisegundos y, por formulación, reúnen más de 50,000 eventos en 20 minutos (de 3,000 a 5,000 eventos por minuto).

Y se reparten el trabajo tres marcadores de colores distintos.

Con la combinación de encendidos simultáneos de estos tres colores se distinguen tres tipos.

• LNP con ARNm = YOYO-1 (−), TMR (+), Cy5 (+)
• LNP vacía = solo TMR (+)
• ARNm desnudo, sin envolver = YOYO-1 (+), Cy5 (+), TMR (−)

Cómo se contó si eran una, dos o tres moléculas

Aquí está la parte más ingeniosa del artículo. El brillo del Cy5 queda determinado a grandes rasgos por «cuántas moléculas de ARNm hay», pero depende al mismo tiempo de la dispersión en el número de Cy5 que lleva cada molécula, las fluctuaciones poissonianas de la emisión y la detección de fotones, y las variaciones de la potencia del láser y de la velocidad de flujo. Por eso no se puede afirmar partícula por partícula «esta brilla mucho, luego lleva tres».

Los autores recurrieron en su lugar a resolver la distribución (una deconvolución).

1. Primero se mide experimentalmente la distribución de brillo de una sola molécula de ARNm desnuda (el artículo la escribe D(RNA,1))
2. Si se multiplica por n el brillo de esa distribución, se obtiene D(RNA,n), la distribución de «partículas que llevan exactamente n moléculas»
3. Se ajustan los pesos w(n) para que la distribución medida de las LNP se reproduzca con una suma ponderada de D(RNA,1), D(RNA,2), etc.
4. El conjunto óptimo de pesos es ya, tal cual, la respuesta: qué porcentaje lleva una molécula, qué porcentaje lleva dos, y así sucesivamente

La optimización se hizo con el método de recocido simulado de MATLAB, imponiendo un coeficiente de penalización α = 0.1 para que la suma de los pesos no se desvíe más del 1% del número total de partículas medido. El límite superior de carga que se considera se fijó en 6 veces el valor estimado de la carga media (el cociente entre las medias geométricas de la fluorescencia de las LNP con ARNm y la del ARNm desnudo).

👦 Estudiante: Se dice «contar de una en una», pero al final es una estimación de la distribución, ¿no?

🧬 Dr. Exotaro: Buena observación. El dictamen de «con contenido o sin contenido» es partícula por partícula, mientras que «cuántas moléculas» es una estimación hecha sobre el conjunto. Es una distinción que conviene entender con exactitud y volveré a ella en la lectura crítica.

¿Qué se descubrió en este artículo?

① Los valores medidos de la formulación estándar: el 77% iba de vacío

Lo que se midió fue la formulación de referencia que se usa habitualmente en la literatura: el lípido ionizable DLin-MC3-DMA, el lípido auxiliar DSPC, colesterol y el lípido PEG DMG-PEG2000 en una relación molar de 50:10:38.5:1.5. El ARNm era un producto marcado con Cy5 de 1929 nucleótidos (nt) a una concentración final de 20 µg/mL y con una relación N/P de 6 (la relación molar entre los grupos amina del lípido ionizable y los grupos fosfato del ARNm). En una unión en T se hacen confluir y mezclarse la solución etanólica de lípidos a 1 mL por minuto y la solución acuosa de ARNm a 3 mL por minuto, y después se dializa con una membrana de corte de peso molecular 3,500 a 4 ℃ durante 12 horas.

Lo decisivo es que se midieron tanto la muestra todavía ácida, a pH 4.0, como la muestra ya devuelta a la neutralidad, a pH 7.4.

⚠️ Hace falta una advertencia sobre la terminología. La tabla 2 del artículo llama a la primera «Before dialysis at pH 4.0», es decir, antes de la diálisis, la LNP inicial, pero, al leer el apartado de métodos, resulta que la muestra a pH 4.0 también se dializó durante 12 horas, frente a un tampón de acetato, para eliminar el etanol. Es decir, en rigor la comparación no es «antes y después de la diálisis», sino entre «lo que se dializó manteniendo el medio ácido» y «lo que se dializó hasta la neutralidad». Como la nomenclatura del propio artículo y la descripción de sus métodos se contradicen, en lo que sigue respetaré la forma de llamarlo del artículo, pero lean teniendo esto en la cabeza. El protagonista del mecanismo es, en todo caso, la desprotonación provocada por el desplazamiento del pH, y no el hecho de haber dializado o no.

A pH 4.0, lo que el artículo llama antes de la diálisis, se vieron tres poblaciones.

• Complejos de ARNm lipófilos, 34% (TMR+ Cy5+; llevan bastante lípido auxiliar)
• Complejos de ARNm no lipófilos, 25% (TMR− Cy5+; apenas llevan lípido auxiliar, son agregados fuertemente cargados de ARNm y lípido ionizable)
• LNP vacías, 41%

A pH 7.4, después de la diálisis, la situación cambia por completo.

• LNP con ARNm, 23%
• LNP vacías, 77%
• ARNm desnudo, sin envolver: solo el 4% de todos los eventos

Atención: hay dos denominadores distintos. El 23% y el 77% son proporciones cuyo denominador son los eventos en los que se encendió el TMR, es decir, las partículas de lípido, mientras que el 4% es una proporción cuyo denominador son todos los eventos detectados (así consta en el pie de la figura 2 del artículo). Por eso los dos primeros suman 100%, y el ARNm desnudo no está incluido ahí.

Y la carga. La media por número de las LNP con ARNm fue de 2.80 ± 0.41 moléculas, la moda fue de 2 moléculas y alrededor de tres cuartas partes llevaban entre 1 y 3 moléculas (n = 6, preparaciones independientes). A pH 4.0 los complejos lipófilos llevaban 3.43 ± 0.38 moléculas, los no lipófilos 1.34 ± 0.20 y el conjunto 2.51 ± 0.24.

También están reunidos los valores medidos complementarios. El tamaño de partícula (media z por dispersión dinámica de luz) fue de 106.3 ± 13.0 nm a pH 4.0 y de 120.5 ± 6.0 nm a pH 7.4. El potencial zeta pasó de +45.1 ± 0.9 mV a −6.3 ± 1.3 mV. La eficiencia de encapsulación fue de 94.2% ± 3.6% con RiboGreen y de 85.6% ± 5.1% calculada a partir del recuento del CICS.

Los autores mostraron además que la discriminación de tres colores era realmente necesaria. Con la discriminación de dos colores, sin YOYO-1, hasta un 10.4% de los eventos se clasifica por error como LNP con ARNm. El trabajo extra tuvo su sentido.

② ¿Por qué aumentan las partículas vacías? Durante la diálisis las partículas «se parten y se pegan»

A pH 4.0 las LNP vacías eran el 41%, y a pH 7.4 son el 77%. Han aumentado. Los autores leyeron aquí el mecanismo de ensamblaje.

La clave es un conocimiento previo: el lípido PEG fija el límite superior del tamaño de la partícula. Como el PEG ocupa un área en la interfase, si la cantidad de los demás lípidos es la misma, cuanto mayor es la proporción de PEG no queda otra que subir la relación entre superficie y volumen, es decir, hacer la partícula más pequeña. De hecho, al aumentar el DMG-PEG del 0.25% al 3%, el tamaño medio de partícula a pH 7.4 se encogió de 210 nm a 100 nm. A pH 4.0, en cambio, cambiar la cantidad de PEG no altera ni el tamaño ni la carga. Es decir, todo el cambio ocurre durante la diálisis.

👦 Estudiante: Pero la diálisis no es más que la operación de quitar el etanol, ¿no?

🧬 Dr. Exotaro: Ahí está la trampa. Cuando la diálisis sube el pH de 4.0 a 7.4, el lípido ionizable pierde su carga positiva. La partícula que a pH 4.0 se mantenía estable por la repulsión de cargas más el PEG tiene que estabilizarse a pH 7.4 solo con el PEG. Al cambiar el modo de sostenerla, la partícula reorganiza su forma. Y además, en ese momento, tiene que pasar de la vesícula de bicapa de pH 4.0 a la estructura de pH 7.4 en la que una sola capa envuelve un núcleo hidrófobo. Con la misma cantidad de lípido hace falta más superficie. Por eso las partículas probablemente se parten: así lo lee el artículo (en los relatos de las figuras 4 y 6 el propio artículo consigna expresamente que se trata de una hipótesis, «hypothesized»).

El relato que presenta el artículo es este. Todo lo que sigue son hipótesis que el artículo formula como inferencias a partir de estadísticas de población, no observaciones del instante en que una partícula se parte o se fusiona.

Cuando hay mucho PEG, del 1.5% en adelante: las LNP vacías se habrían multiplicado al partirse (a partir del hecho observado de que la media de TMR baja y la concentración numérica sube). Se interpreta que parte de los complejos lipófilos que tenían una carga inicial alta también se partieron y bajaron su carga. Los de carga media o baja mantienen la suya. Con muchísimo PEG, del 3.0% en adelante, la partición se vuelve dominante: la carga media baja y el número de partículas sube. En cambio, de los complejos no lipófilos, que no tenían lípido auxiliar, se infiere que se fusionaron con LNP vacías y recibieron de ellas el lípido auxiliar (deducido de que tras la diálisis la distribución de carga queda relativamente homogénea y de que la población que no tenía TMR pasa a tenerlo).

Cuando hay poco PEG, del 1.0% o menos: al relajarse el límite de tamaño, los complejos lipófilos pueden fusionarse entre sí, piensa el artículo. El resultado fue que la carga aumentó mucho. En este caso el aumento de la señal de TMR fue de forma constante mayor que el aumento de la carga de ARNm, lo que es prueba de que el lípido lo están recibiendo de las LNP vacías.

El contraste con los datos reales se entiende bien. Con PEG al 1.5%, las vacías pasan del 41% al 77%; con PEG al 0.5%, del 33% al 81%. En ambos casos las partículas vacías aumentan después de la diálisis.

③ Al bajar la relación N/P, la carga aumenta sin que cambie el tamaño

La siguiente variable que se manipula es la relación N/P. Se mantiene constante la concentración de ARNm y se aumentan o se reducen todos los lípidos en proporción al lípido ionizable. Como la proporción de PEG respecto al lípido total no cambia, el límite superior del tamaño de la partícula tampoco cambia.

Y sin embargo, manteniendo el mismo tamaño, al bajar la relación N/P la carga por partícula aumentó. La razón está en la proporción de existencias: bajar la relación N/P significa que hay relativamente menos lípido respecto al ARNm, y por tanto menos lípido que acaba en LNP vacías. De hecho, la proporción de LNP vacías a pH 4.0 mostró una fuerte correlación positiva con la relación N/P (50% con N/P = 12 y 15% con N/P = 2).

La explicación del artículo es que entonces cambia con quién se encuentra cada partícula durante la diálisis. Si la relación N/P es alta, alrededor solo hay LNP vacías, así que la partícula con ARNm se fusiona con LNP vacías —es decir, recibe solo lípido sin aumentar su ARNm— y alcanza así el tamaño límite. Si la relación N/P es baja, alrededor hay complejos de ARNm, de modo que se fusionan entre sí las partículas que llevan ARNm. Ni lo uno ni lo otro son observaciones: son relatos deducidos de las distribuciones. Hasta llegar al mismo tamaño límite, el número de paquetes que se cargan acaba siendo distinto.

Eso sí, la proporción de partículas vacías a pH 7.4 no disminuyó al bajar la relación N/P. Con una relación N/P baja también baja el número absoluto de LNP vacías, pero, al aumentar la carga, baja igualmente el número de LNP con ARNm. La explicación es que ambos efectos se compensan y la proporción no se mueve.

④ La concentración no influye, el tamaño sí: «la carga no se mide en número de moléculas, sino en masa»

Al variar la concentración de ARNm veinte veces, de 5 a 100 µg/mL, aumentando también los lípidos en proporción, ni el tamaño de partícula ni la distribución de carga cambiaron apenas (solo la proporción de partículas vacías fue la más baja a la concentración mínima de 5 µg/mL, y entre 20 y 100 µg/mL fue prácticamente igual).

Esto va contra lo que se da por sabido en el mundo de los polímeros. En los complejos de pDNA con polietilenimina se sabía que, al subir la concentración de ácido nucleico, las partículas de carga alta quedan congeladas dinámicamente. Los autores lo interpretan diciendo que el lípido catiónico se mueve más rápido que un policatión, por lo que accede de sobra al ARNm y le cuesta entrecruzar varias moléculas de ARNm a la vez.

Lo que sí influyó fue la longitud del ARNm. Al cambiar los 1929 nt por 996 nt, casi la mitad, el límite de tamaño no varió y en cambio la carga media aumentó de forma significativa, y la moda se multiplicó por 2 tanto a pH 4.0 como a 7.4. La proporción de partículas vacías disminuyó también con N/P = 3 y con N/P = 6.

🧬 Dr. Exotaro: La frase que sale de aquí es la conclusión más bonita del artículo: la capacidad de carga de una LNP que tiene un límite superior de tamaño dado no se expresa en número de moléculas de ARNm, sino como una masa determinada. Como el volumen de la caja está fijado, si los paquetes son pequeños caben muchos. Que haya un estudio con siRNA cargado, de unos 20 nt, en el que se informa de que no existían LNP vacías se conecta con el mismo razonamiento.

⑤ Al añadir partículas vacías, la expresión en el hígado bajó

Por último, se comprueba si todo esto tiene algún significado dentro del organismo. Además de las formulaciones con N/P = 3 y N/P = 6 (según lo que escribe el artículo, en ambas hay alrededor de un 75% de partículas vacías; se desvía un poco del valor de referencia de la tabla 2, 77% ± 8%, pero las dos cifras son del propio artículo), se preparó una tercera, la N/P = 3+3, en la que a las LNP hechas con N/P = 3 se les mezclaron después LNP vacías hasta llevar la relación N/P total a 6 (86% de partículas vacías). Es un grupo en el que, sin cambiar el número de LNP con ARNm, solo las vacías se multiplicaron unas 2 veces.

Se cargó ARNm de luciferasa y se administraron 0.5 mg de ARNm/kg por la vena de la cola a ratones Balb/cJ (hembras, de 8 semanas de edad); 12 horas después se inyectó D-luciferina por vía intraperitoneal, se tomaron imágenes con IVIS y se extrajeron los órganos para cuantificarlos.

• Hígado: en el grupo al que se añadieron LNP vacías (N/P = 3+3) la expresión bajó (P = 0.0298, prueba t bilateral para muestras no emparejadas, comparación entre N/P = 3 y N/P = 3+3). La cantidad distribuida al hígado en sí no cambió
• Bazo: solo los dos grupos derivados de N/P = 3 (el 3 y el 3+3) mostraron una expresión apreciable, y con N/P = 6 apenas hubo expresión (P = 0.0280)

Se considera que las LNP se concentran en el hígado por su interacción con la apolipoproteína E (ApoE) de la sangre. Los autores plantean la posibilidad de que las LNP vacías compitieran con las LNP con ARNm por la ApoE, pero cierran con prudencia diciendo que «hacen falta más estudios».

¿Cómo cambiará el futuro? (el camino hacia la clínica)

Se pueden incorporar al control de calidad de la fabricación indicadores vistos desde el lado de la partícula

Este es el uso más realista. Como el CICS mide en flujo, la cantidad de muestra es mínima y en 20 minutos por formulación despacha más de 50,000 eventos (entre los eventos se incluyen también otras especies, como el ARNm desnudo). El artículo lo aplicó asimismo a evaluar la estabilidad en almacenamiento (figura suplementaria 12).

Lo que hoy se usa para juzgar un lote de formulación de LNP es el tamaño de partícula, el índice de polidispersidad, el potencial zeta y la eficiencia de encapsulación. ¿Qué pasaría si a eso se sumaran la tasa de partículas vacías y la distribución de carga por partícula? Aunque dos lotes tengan la misma eficiencia de encapsulación del 94%, entre uno con una tasa de partículas vacías del 77% y otro del 50%, la cantidad total de lípido que se transporta al administrar la misma cantidad de ARNm es distinta. Es decir, se podría gestionar como indicador la carga lipídica necesaria para obtener el mismo efecto.

Se ha hecho visible una dirección de optimización: reducir las partículas vacías

Este artículo ordenó qué se mueve cuando se gira cada mando. La cantidad de PEG fija el límite superior del tamaño de la partícula, la relación de masas entre el lípido y el ARNm decide el reparto inicial entre los complejos de ARNm y las LNP vacías, y la partición y la fusión durante la diálisis dan el acabado. La concentración no influye. Si la carga es pequeña, las partículas vacías disminuyen.

👦 Estudiante: Entonces bastaría con fabricar LNP con cero partículas vacías, ¿no?

🧬 Dr. Exotaro: Lo interesante es que no es tan simple. Si se baja la relación N/P para reducir las vacías, la carga por partícula aumenta y el número de partículas baja. En los experimentos con animales de este artículo, con N/P = 6 apenas hubo expresión en el bazo, mientras que con N/P = 3 sí la hubo. Unas pocas partículas muy cargadas y muchas partículas poco cargadas se comportan de forma distinta dentro del organismo, aun con la misma cantidad total de ARNm. El óptimo cambia según adónde se quiera llegar. La tasa de partículas vacías no hay que leerla como un mal que haya que reducir, sino como uno de los grados de libertad del diseño.

Por otro lado, la distancia hasta la clínica es, con franqueza, grande

Este artículo no tiene datos clínicos. El experimento en ratones es, además, de dosis única, en un solo punto temporal a las 12 horas, solo en hígado y bazo y con un gen indicador. La administración repetida, la respuesta inmunitaria, la expresión de una proteína terapéutica y la farmacocinética en humanos quedan fuera de su alcance. Y, como escribiré en la sección siguiente, la formulación que se midió no es la formulación de las vacunas actuales.

Cómo leer este estudio con ojo crítico (limitaciones y vías para elevar su calidad)

Lo que se puede valorar

Lo escribiré con justicia. El diseño de la medición es correcto. La idea de cubrir la sección con una lámina de luz para igualar la eficiencia de detección, el diseño de distinguir tres tipos por el encendido simultáneo de tres colores y el planteamiento de medir experimentalmente la distribución de una sola molécula de ARNm desnuda y usarla como base apuntan todos hacia un «recuento sin trampas». Al medir tanto antes como después de la diálisis, una descripción estática se convirtió en un relato de mecanismo. Es también honesto que cuantificaran ellos mismos que con dos colores se puede clasificar mal hasta el 10.4% de los eventos. Y lo respaldan con un método ortogonal: observaron con microscopía confocal de superresolución LNP fijadas en resina y confirmaron por otra vía que hay muchas vacías. Y el código se proporciona a petición y los datos de origen se adjuntan. Su actitud hacia la reproducibilidad es buena.

Puntos que conviene leer con cuidado

① Esto no es una medición de las vacunas de ARNm actuales. Lo pongo primero porque es el punto que más fácilmente se malinterpreta. El lípido ionizable que se usó fue DLin-MC3-DMA (el lípido que se puso en uso con patisirán, el fármaco de siRNA), no el ALC-0315 de la vacuna contra la COVID-19 (BNT162b2) ni el SM-102 (mRNA-1273). El ARNm es también un ARNm comercial marcado con colorante en el que el 25% de la uridina se sustituyó por el derivado marcado con Cy5, algo distinto del ARNm modificado con N1-metilpseudouridina que se usa en las vacunas. La diálisis es asimismo un lote de 12 horas a escala de laboratorio, diferente de la filtración de flujo tangencial industrial. Resumirlo como «ocho de cada diez partículas de la vacuna iban vacías» es una lectura errónea de este artículo.

② No se demuestra que la fluorescencia sea lineal. La deconvolución depende por completo del supuesto de que «el brillo de una partícula con n moléculas es n veces la distribución de una sola». Pero los colorantes, cuando se apiñan, sufren autoextinción, y si la distancia es corta también hay transferencia de energía. El artículo no verifica si el Cy5 brilla realmente n veces cuando varias moléculas de ARNm están apretadas en el núcleo lipídico. Si hubiera extinción, la carga quedaría subestimada. Con un control que encapsulara una cantidad conocida de ARNm, o con un experimento que examinara si hay extinción o no, este supuesto habría quedado mucho más firme.

③ Las unidades de la concentración numérica de partículas no cuadran. En la tabla 2, la concentración numérica de LNP con ARNm figura como 1.29 × 10¹⁶ ± 2.22 × 10¹⁵ mL⁻¹. Pero, si se estima a partir de la cantidad de ARNm que se puso, 20 µg/mL de un ARNm de 1929 nt (peso molecular de alrededor de 6.4 × 10⁵) son unas 1.9 × 10¹³ moléculas/mL, y con una eficiencia de encapsulación del 85.6% y 2.80 moléculas por partícula salen del orden de 6 × 10¹² partículas/mL. El valor consignado es unas 2,000 veces mayor. Incluso suponiendo que la unidad fuera L⁻¹ seguiría quedando una discrepancia de unas 2.2 veces, de modo que tampoco se puede dar por establecido que sea un error de unidades. El detalle del cálculo está en el material suplementario (Supplementary Discussion 2 a 5) y no se puede seguir desde el texto principal, así que no lo afirmo de forma tajante; pero quien cite la cifra leyendo solo el texto principal se equivocará de orden de magnitud. Por lo demás, la relación entre las vacías y las que llevan ARNm (4.88 × 10¹⁶ frente a 1.29 × 10¹⁶ ≒ 79% frente a 21%) es coherente con el 77% y el 23%, de modo que leerlo como una relación no da ningún problema.

④ Hay una frase contradictoria en el texto principal. Justo después de argumentar que la discriminación de tres colores es necesaria, se escribe: «por tanto, para obtener mayor precisión en el cálculo de la distribución y la capacidad de carga se empleó el método de discriminación de dos colores». Por el contexto, lo natural es leerlo como una errata por «se empleó la discriminación de tres colores», pero que no se pueda determinar desde el texto principal con cuál de los dos métodos se obtuvieron los resultados principales es doloroso en un artículo que vende el recuento. De forma parecida, la longitud de onda del láser discrepa: 647 nm en el apartado de resultados y 640 nm en el de métodos (por el nombre del producto, el correcto es 640 nm). El pie de la figura 7 remite además al resultado del hígado como «panel i», cuando en realidad es el panel l. Nada de esto invierte las conclusiones, pero son defectos que se podrían haber eliminado en la corrección de pruebas.

⑤ La denominación «antes de la diálisis» discrepa de los métodos. Vuelvo a plantear como limitación el punto que he mencionado arriba. La tabla 2 llama a la muestra de pH 4.0 «antes de la diálisis, la LNP inicial», pero el apartado de métodos consigna expresamente que la muestra de pH 4.0 también se dializó durante 12 horas (frente a un tampón de acetato, para eliminar el etanol). Lo que se compara no es si hubo diálisis o no, sino el pH hacia el que se dializó. La tesis del artículo —que al subir el pH y producirse la desprotonación la partícula se reorganiza— no se tambalea con esta corrección, pero quien tome la expresión «antes de la diálisis» al pie de la letra entenderá por error que se midieron partículas que aún conservaban etanol. Deberían haber unificado el lenguaje de la tabla y el de los métodos.

⑥ El «mecanismo» es casi todo hipótesis. El relato de la partición y la fusión de las figuras 4 y 6 es, tal como el propio artículo escribe con hypothesized y presumably, una inferencia a partir de estadísticas de población: proporciones, medias geométricas de TMR y concentraciones numéricas. No se observó con resolución temporal el instante en que una partícula concreta se parte o se fusiona. Hay el respaldo de que concuerda con informes previos de FRET y de criomicroscopía electrónica, pero queda la distancia entre decir «esto tiene que ser así» y decir que así es.

⑦ La n es pequeña y eso debilita las conclusiones negativas. Casi todas las condiciones tienen n = 3 (solo la formulación de referencia tiene n = 6). Para sostener con n = 3 afirmaciones de ausencia de diferencia como «la concentración no influye en la carga» o «el tamaño del ARNm no influye en el tamaño límite», uno querría ver un diseño de equivalencia y una descripción de la potencia estadística.

⑧ La brecha entre los dos valores de eficiencia de encapsulación no se cierra. Sobre la diferencia de unos 9 puntos entre el 94.2% de RiboGreen y el 85.6% del CICS, el artículo solo los presenta uno al lado del otro y no discute la razón. Cuál de los dos está más cerca de la verdad, y si la diferencia viene de la eficiencia de detección o del acceso del colorante, atañe a la fiabilidad misma del recuento.

⑨ Hay un factor de confusión en la interpretación del experimento con animales. El grupo N/P = 3+3 es un grupo al que se añadieron LNP vacías. Es decir, también aumentó la cantidad total de lípido administrada. Si la bajada de expresión en el hígado se explica por la competencia por la ApoE, hace falta un control con la misma cantidad total de lípido (por ejemplo, un grupo al que se añada la misma cantidad de liposomas irrelevantes en lugar de LNP vacías). Es acertado que los autores eviten afirmarlo de forma tajante, pero la lectura de que «las partículas vacías estorban» no queda establecida solo con estos datos. A eso se suma que la n es de 3 a 4, que hay un solo punto temporal a las 12 horas, que solo se usaron hembras y que solo se usó una cepa.

⑩ Lo que se mide es el estado posterior a la dilución y a más de una hora de reposo. El CICS diluye la muestra, la incuba con YOYO-1 en oscuridad durante más de una hora y después mide durante 20 minutos. Como una LNP no es una estructura rígida en equilibrio, si su estado no se mueve durante el pretratamiento de la medición es algo que en principio uno querría comprobar (que mostraran la estabilidad en almacenamiento es buena señal, pero no es una verificación del pretratamiento en sí).

⑪ Falta la conexión entre la carga y la función. Aunque se sepa cuántas moléculas lleva cada partícula, no se ha medido cómo se relaciona eso con el escape endosomal o con la cantidad de traducción. Cuántas veces difiere la producción de proteína cuando entra en la célula una partícula con 2 moléculas frente a una con 8. Solo cuando se llene ese hueco quedará completa la tasa de partículas vacías como indicador de diseño.

¿Qué habría hecho de esto un estudio de más calidad?

• Incluir una verificación de la extinción. Confirmar la linealidad con partículas estándar que encapsulen un número conocido de copias de ARNm, o con ARNm de distinta tasa de marcaje con Cy5. Así se afirma el cimiento de la deconvolución
• Hacer la misma medición con las formulaciones de las vacunas actuales, ALC-0315 y SM-102. Es la principal extrapolación de este trabajo y la cifra que más querrían saber los lectores
• Cotejar mecánicamente las cifras y las unidades. Las unidades de la concentración numérica de partículas, la descripción de los dos o tres colores, la longitud de onda del láser y las referencias a las figuras se pueden eliminar con una lista de comprobación antes de enviar el manuscrito
• Observar el mecanismo de forma directa. Captar la partición y la fusión en tiempo real con flujo detenido más FRET resuelto en el tiempo, o con un microcanal que permita seguir el proceso de diálisis
• Igualar la cantidad total de lípido en el experimento con animales. Si se quiere sostener un efecto de las LNP vacías, hace falta un grupo de control con la misma cantidad de lípido. También el curso temporal tras la administración y varios órganos
• Unir la carga y el nivel de expresión a escala de célula individual. Fabricar por separado partículas de carga homogénea y medir al mismo tiempo el número captado y la producción de proteína

La visión del Dr. Exotaro

El autor corresponsal investiga la misma enfermedad que yo

Lo diré con franqueza. La fisicoquímica de la formulación de las LNP de ARNm no es exactamente mi especialidad. A lo que yo me dedico es al tratamiento de enfermedades neurológicas, empezando por la lesión de la médula espinal, con células madre mesenquimales (mesenchymal stem cell, MSC) y con las vesículas extracelulares (extracellular vesicle, EV) que estas liberan.

Aun así, una de las razones por las que elegí este artículo fue que el laboratorio de Mao, el autor corresponsal, hace de verdad medicina regenerativa de la lesión medular. Como ya he dicho: la inyección de un compuesto de nanofibra e hidrogel en la contusión medular de la rata en Biomaterials de 2020, y el tratamiento de la lesión medular combinando MSC con ese compuesto en Cells de 2022. La investigación que cuenta nanopartículas de una en una y la investigación que lleva MSC a la médula lesionada están bajo el mismo techo. No creo que sea casualidad. Las dos son los dos extremos de una misma pregunta: «hasta qué punto sabemos qué hay dentro del transportista».

La lección más grave: hablamos demasiado en términos de medias

Lo que este artículo me puso delante no fue el método ni las cifras, sino la manera de formular la pregunta.

Recuerden las cifras que nosotros escribimos en los artículos sobre EV. Por análisis de seguimiento de nanopartículas, «cuántas partículas hay en 1 mL». Extrayendo el ARN en otro tubo de ensayo, «cuántos ng de ARN» o «cuántas copias de este miARN». Y luego dividimos y decimos «cuántas copias por partícula».

Es exactamente esa «carga media en bruto» que este artículo mostró que no se puede entender con una media. Una media que divide la cantidad total del conjunto por el número de elementos del conjunto. No responde a «en qué partícula y cuántas moléculas hay». (Por si acaso: no es lo mismo que la eficiencia de encapsulación. La eficiencia de encapsulación es una proporción del lado del ARNm, «qué fracción del ARNm que se puso quedó envuelta», y no se obtiene dividiendo para sacar el número de moléculas por partícula. Lo que este artículo derribó es más bien el hablar en términos de medias.)

En el campo de las EV ya había una advertencia. Chevillet y colaboradores analizaron en PNAS 2014, volumen 111, número 41, página 14888 el contenido de miARN de los exosomas de forma cuantitativa y estequiométrica, y comunicaron que la mayoría de los exosomas individuales no transportan un número biológicamente significativo de miARN. Para un miARN concreto cuya media por partícula queda por debajo de 0.01 copias, lo que significa «una media de 0.01 copias» no es «hay 0.01 copias en cada partícula», sino «la gran mayoría de las partículas va con las manos vacías y solo una fracción muy pequeña lleva una o más» (la forma de la distribución no queda determinada solo por la media, así que no se puede afirmar que «una partícula de cada 100 lleve exactamente una»). Estructuralmente, es la misma historia que el 77% de LNP vacías.

Esto lo escribo yo mismo, como autocrítica. Cuando atribuyo el efecto terapéutico de las EV de MSC a un miARN concreto, yo no he medido qué porcentaje del total representan las partículas que llevan realmente ese miARN. Lo que los autores de este artículo hicieron con partículas sintéticas, nosotros todavía no hemos podido hacerlo con partículas de origen biológico.

Eso sí, las cifras no se pueden trasladar: lo único que se traslada es la pregunta

Aquí escribo con cautela. Las LNP y las EV son cosas distintas. Las LNP son partículas sintéticas que se diseñan y se ensamblan, de composición conocida y con una distribución de tamaños que se puede controlar. Las EV las fabrica un ser vivo, así que cada partícula es distinta, en su membrana hay incrustadas proteínas de membrana como las tetraspaninas y su superficie está cubierta por una capa de proteínas. No hay en ninguna parte base para aplicar a las EV la cifra del 77% de partículas vacías.

Lo que se traslada es la pregunta y la metodología. Y, de hecho, la metodología está sorprendentemente cerca. El CICS es la técnica de «hacer fluir en fila por un capilar, clasificar por el encendido simultáneo de varios colores y estimar el número tomando como base una distribución conocida de moléculas individuales». El análisis de vesículas individuales (single-EV analysis) que se está extendiendo ahora en el campo de las EV, y la citometría de flujo de alta sensibilidad basada en microcanales, están en la misma dirección y con la misma idea.

👦 Estudiante: Entonces basta con hacer lo mismo con las EV, ¿no?

🧬 Dr. Exotaro: Hay que hacerlo y quiero hacerlo. Pero le añado una advertencia a mí mismo que he aprendido de este artículo. Lo que permitió a este artículo afirmar con más fuerza fue haber medido tanto antes como después de la diálisis. Si solo hubiera medido el producto acabado, se habría quedado en el hecho de que «ocho de cada diez van vacías» y no habría llegado al «por qué es así». Con las EV ocurre lo mismo: si solo medimos el producto acabado que recogemos del sobrenadante del cultivo, nunca en la vida sabremos por qué la distribución es esa. La etapa en que la célula carga la EV, la etapa de liberación, la etapa de recogida y purificación: hay que medir proceso a proceso dónde se decide qué. Nosotros ahora medimos casi solo el producto acabado.

La distancia hasta el destino sigue sin cubrirse

Por último, como tarea propia. Lo que mostró el experimento con animales de este artículo es la entrega al hígado y al bazo. Son los órganos a los que más fácilmente llega una nanopartícula inyectada por vía intravenosa y, además, va montada sobre un mecanismo conocido, el de la ApoE. Lo que yo quiero alcanzar, en cambio, es el tejido nervioso lesionado que está al otro lado de la barrera hematoencefálica y de la barrera hematomedular.

Poder contar con exactitud lo que hay dentro de una partícula y lograr que esa partícula llegue son dos problemas distintos. Con todo, en cuanto al orden, lo que no se puede contar no se puede optimizar. Ahora que ha salido la cifra de «2 moléculas por partícula», la discusión de «cuántas partículas hacen falta entonces» y «cuánto lípido vamos a tener que cargarle» se ha convertido por fin en un cálculo y no en una conjetura.

Y yo confío en la manera misma en que está escrito este artículo. En la explicación de su propio mecanismo escriben «hypothesized» y «presumably», y en la interpretación del experimento con animales escriben que hacen falta más estudios. No mezclan lo que midieron con lo que conjeturaron. Es discreto, pero me parece la actitud que corresponde a un artículo que vende el recuento.

Por lo demás, este artículo forma pareja con «El “potenciador” de las vacunas de ARNm no era el contenido, sino el envase», publicado el mismo día. Este trata de que «la mayoría de las LNP va de vacío» y aquel de que «son precisamente esas partículas vacías las que desencadenan la inmunidad innata». Leídos juntos, ganan un grado de interés.

Nota: este artículo se ha redactado con la ayuda de IA.