把运送mRNA的脂质纳米颗粒逐粒数了一遍——装着的mRNA平均2.8条，而八成的颗粒是“空载”在跑

脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle, LNP）是把脆弱的mRNA包进脂质微粒、一路运送到细胞内部的运输工具。它随着mRNA疫苗一举走向实用，如今也被用在把基因编辑工具送往肝脏的治疗里。

这里提一个朴素的问题。那一颗颗粒里，到底装着几条mRNA？

几乎没有人能立刻回答。制剂的质量标示里出现的，是“包封效率（encapsulation efficiency, EE）94%”这样的数字。它的意思是“投入的mRNA里有94%进到了颗粒内部”，也就是从mRNA这一侧看到的比例。至于从颗粒这一侧看的“每一颗里有几条”“有多少颗是空手的”，它一个字也没有回答。

这次要介绍的，是对这个问题逐粒给出答案的2022年 Nature Communications 论文。先把结论写在前面。在标准的实验用处方LNP里，在装了mRNA的颗粒之中，每一颗的平均是 2.80条，众数是 2条。而全部颗粒中的 77%，一条mRNA也没有装。

先说明两点。第一，这是 2022年 的论文。现在仍要介绍它，是因为我认为这里得出的“大半都是空载”这个数字，已经成为此后思考这个领域时的出发点，而且它的测量思路可以直接切进我们的细胞外囊泡（extracellular vesicle, EV）研究。第二，被测量的是 市售的染料标记mRNA，以及在可电离脂质上使用DLin-MC3-DMA的“教科书式”实验用处方。这不是一篇测量新冠疫苗本身的论文。请不要把这两件事混为一谈。

期刊信息

• 论文标题：Payload distribution and capacity of mRNA lipid nanoparticles（mRNA脂质纳米颗粒的装载量分布与容量）
• 论文类型：原创研究论文（测量技术开发＋制剂物理化学）
• 发表期刊：Nature Communications 2022年第13卷 论文编号5561（2022年1月13日收稿，9月5日接受，9月23日在线发表）
• DOI / 链接：10.1038/s41467-022-33157-4
• 许可：开放获取（CC BY 4.0）。任何人都可以读到全文
• 影响因子：大致在 15左右（逐年有波动。在综合性科学期刊中也属于最顶尖的一类）
• 作者：Sixuan Li、Yizong Hu（这两人为共同第一作者）、Andrew Li、Jinghan Lin、Kuangwen Hsieh、Zachary Schneiderman、Pengfei Zhang、Yining Zhu、Chenhu Qiu、Efrosini Kokkoli、Tza-Huei Wang、Hai-Quan Mao 共12人
• 单位：全部为约翰斯·霍普金斯大学（美国马里兰州巴尔的摩）。机械工程系、纳米生物技术研究所（INBT）、医学院生物医学工程系、Translational Tissue Engineering Center、化学与生物分子工程系、材料科学与工程系
• 通讯作者：Yizong Hu、Tza-Huei Wang、Hai-Quan Mao 共3人（论文明确写出 Wang 与 Mao “作为共同通讯作者贡献相等”）
• 资助：美国国家过敏症和传染病研究所（NIAID）的 U01AI155313（Mao）与 R01AI137272（Wang）
• 利益冲突披露：Li、Hu、Wang、Mao 这4人就本论文的技术提交了专利申请（经由约翰斯·霍普金斯大学 Office of Technology Ventures）。其他作者没有申报
• 同行评审：按 Nature Communications 的方针，评审报告是公开的，作为评审人之一，Xucheng Hou 的名字也被披露了

通讯作者是怎样的研究者

Hai-Quan Mao 领导着约翰斯·霍普金斯大学纳米生物技术研究所（INBT），同时兼任材料科学与工程系和医学院生物医学工程系的教授。他的经历有点特别：在中国武汉大学取得化学学士（1988年）和高分子化学博士（1993年），并在同校当过讲师，之后于1995〜1998年在约翰斯·霍普金斯大学做博士后。1999〜2003年任 Johns Hopkins Singapore 的共同研究负责人，2001〜2003年兼任新加坡国立大学助理教授，2003年成为约翰斯·霍普金斯大学 Whiting School of Engineering 的教员。2016年出任INBT副所长，现在是所长。英国皇家化学会会士（2014年），美国医学与生物工程院（AIMBE）会士（2018年），美国国家发明家科学院（NAI）会士（2023年）。

研究的支柱有两根。一根是被称为 flash nanocomplexation（FNC）的手法，它让“把核酸或蛋白质与高分子混合做成纳米颗粒”的工序变得可以放大生产。另一根是纳米纤维—水凝胶复合体（nanofiber-hydrogel composite, NHC），这是把静电纺丝得到的聚己内酯（PCL）纳米纤维片段用共价键编进透明质酸的凝胶网络里、可以注射的支架材料。

这里有一点对我来说很重要，所以先写出来。 这个 Mao 实验室，确实在推进把那个NHC用到脊髓损伤上的研究。Biomaterials 2020年第245卷119978（第一作者 Xiaowei Li，末位作者 Mao）是把NHC注入大鼠脊髓挫伤（contusion）模型的研究；而 Cells 2022年第11卷第7号1137（第一作者 Agnes Haggerty，Mao 与 Martin Oudega 为共同作者，开放获取）里，他们把骨髓来源的间充质基质细胞（mesenchymal stromal cell, MSC）与NHC组合起来注入损伤的脊髓。也就是说，这篇论文的通讯作者，是在同一个实验室里同时做mRNA-LNP的物理化学和MSC×脊髓损伤再生医学的人。后半段我会回到这个话题。

Tza-Huei（Jeff）Wang 是该校机械工程系的 Louis M. Sardella 讲席教授（2021年设立的捐赠讲席），同时兼任生物医学工程系，并主持 BioMEMS and Single Molecule Dynamics Lab。他在加州大学洛杉矶分校（UCLA）取得机械工程博士（2002年），同年入职约翰斯·霍普金斯大学，2013年7月起任正教授。AIMBE会士（2017年，因纳米生物传感器与单分子检测在遗传及表观遗传疾病分析方面的成绩入选）。论文超过150篇，专利20件以上。

这篇论文的核心技术本身，就是 Wang 实验室的发明。 正文里使用的 CICS（cylindrical illumination confocal spectroscopy，圆柱照明共聚焦光谱法）是该实验室在 Biophysical Journal 2008年第95卷2964页上发表的手法。他们平时的主题是用 digital high-resolution melting 读取液体活检（血液中的微量DNA）的甲基化来早期发现癌症，而“把极少数的分子一个一个准确数出来”这一点，与这次的LNP分析是共通的。

共同第一作者兼通讯作者的 Yizong Hu，按作者贡献栏的记载，是构思出这项研究的人。他在清华大学取得高分子材料学士（2016年），在约翰斯·霍普金斯大学取得生物医学工程博士（2022年）。按公开的个人资料，此后他在麻省理工学院（MIT）做博士后，研究非病毒基因递送。

说到底，此前究竟什么是不清楚的？

“包封效率94%”没有回答的那个问题

谈LNP的质量时一定会出现的就是包封效率。测法很简单：用像 RiboGreen 这样会与核酸结合并发光的染料，比较“用表面活性剂破坏颗粒之前”和“破坏之后”的荧光。破坏之前只有露在外面的mRNA会发光，破坏之后则是全部发光。从这个差值就能得出“有多少%曾在颗粒内部”。

👦 学生：既然有94%都进去了，感觉这就足够了。

🧬 艾克索太郎：不，是问题提错了。这是对货物点名。它说的是“发出的100件货里有94件装上了卡车”。可我们想知道的是卡车那一侧的事情——“有多少辆卡车在跑，一辆上装了几件，有多少辆是空着在跑”。点名是永远回答不了的。

这不是玩文字游戏。知道了每一颗的装载量，就能知道颗粒的数目。知道了颗粒的数目，就能讨论“一个细胞要摄取多少颗才会起效”。而如果空载的颗粒很多，那就等于在给患者注射对疗效毫无贡献的脂质。脂质本身会刺激免疫、给肝脏带来负担，这是已知的事，所以这里也直接连到安全性的话题上。

为什么谁都测不出来

已有的测量方法，个个都差了一步。

冷冻电子显微镜（cryo-TEM）可以直接看到颗粒。可是在生理性的pH 7.4下，可电离脂质失去电荷，会在颗粒中心形成疏水的无定形内核，于是不管里面有没有mRNA，看起来都是同样黑乎乎地塞满。这篇论文也拍了不加mRNA做出来的空LNP，但分辨不出来。

小角中子散射、NMR、纳米颗粒跟踪分析（NTA）也撞上同一面墙。它们能给出颗粒的大小和平均结构，却无法对每一颗判定有无内容。

于是作者们选的是荧光。不过普通的显微镜还不够。他们需要的，是一台几乎不漏过任何一个颗粒、让它们一个一个通过、并记录哪几种颜色同时发了光的装置（论文的表述是“质量检测效率 接近100%”）。

CICS——让颗粒一粒一粒通过毛细管的“闸机口”

CICS的构想是这样的。在内径 10 µm、细如发丝的石英毛细管里，用压力（氩气 42 psi）把样品推着流过去。流速是 1 mm/秒。再把3束激光（488 nm、552 nm、640 nm）用合束器并成一束，以圆柱透镜横向拉伸成的“光片”打上去。

👦 学生：为什么不是普通的点，而要做成片状呢。

🧬 艾克索太郎：是为了把闸机口整个宽度都堵住。如果把激光聚成一个点，只有从毛细管中央通过的颗粒才会亮，从边缘通过的颗粒就暗。这样一来，“暗的颗粒”就无法与“内容少的颗粒”区分开。用光片把整个截面都覆盖住，那么不管从哪里通过，发出的亮度都一样。论文把这一点表述为 接近100%的质量检测效率。意思是所有颗粒都过闸机，而且所有颗粒都在相同条件下过。

检测器是3台能数单光子的雪崩光电二极管（APD）。以0.1毫秒为间隔记录，每个处方 在20分钟内收集5万个以上的事件（每分钟3,000〜5,000个事件）。

然后分别使用3种颜色的标记。

用这3种颜色的同时亮灯组合，来判别3个种类。

• 装有mRNA的LNP = YOYO-1（−）、TMR（＋）、Cy5（＋）
• 空的LNP = 仅TMR（＋）
• 没有被包裹的裸露mRNA = YOYO-1（＋）、Cy5（＋）、TMR（−）

“是1条、2条还是3条”是怎么数出来的

这里是这篇论文技巧性最强的部分。Cy5的亮度大致由“有几条mRNA”决定，但同时也受每一条上Cy5数目的离散、光子发射与检测的泊松波动、激光功率和流速的变动的左右。所以不能逐粒断定“这颗很亮所以是3条”。

作者们改用了解开分布这一招（去卷积）。

1. 先实测单条裸露mRNA的亮度分布（论文把它写成 D(RNA,1)）
2. 把这个分布的亮度放大 n 倍，就得到“正好装了 n 条的颗粒”的分布 D(RNA,n)
3. 调整权重 w(n)，使实测的LNP分布能够用 D(RNA,1)、D(RNA,2)、… 的加权求和重现出来
4. 最优的权重组合，直接就是 “装1条的占多少%、装2条的占多少%…” 这个答案

最优化用的是MATLAB的模拟退火法，并施加惩罚系数 α = 0.1，以保证权重的总和与实测的颗粒总数偏离不超过1%。纳入考虑的装载量上限，被设定为平均装载量估计值（装有mRNA的LNP与裸露mRNA的荧光几何平均之比）的 6倍。

👦 学生：说着“逐粒清点”，结果还是对分布的估计啊。

🧬 艾克索太郎：问得好。“有内容／没内容”的判定是逐粒做的，“有几条”则是作为群体的估计。这是必须准确理解的区别，后面的批判性讨论里我还会再提一次。

这篇论文弄清了什么？

① 标准处方的实测值——77%是空载的

测的是文献里常用的基准处方。可电离脂质 DLin-MC3-DMA、辅助脂质 DSPC、胆固醇、PEG脂质 DMG-PEG2000，摩尔比为 50:10:38.5:1.5。mRNA用的是 1929个核苷酸（nt） 的Cy5标记品，终浓度 20 µg/mL，N/P比6（可电离脂质的胺基与mRNA的磷酸基的摩尔比）。把脂质乙醇液以每分钟1 mL、mRNA水溶液以每分钟3 mL流进T型接头里混合，再用截留分子量3,500的膜，在 4 ℃、12小时 的条件下透析。

决定性的一点是，他们把保持酸性（pH 4.0）的状态和回到中性（pH 7.4）之后的状态都测了。

⚠️ 术语上有一点需要注意。 论文的表2把前者称为“Before dialysis at pH 4.0（透析前＝最初的LNP）”，但读方法一节就会发现，pH 4.0的样品也透析了12小时——对着乙酸缓冲液，为的是把乙醇抽掉。也就是说，严格来讲这不是“透析的前与后”，而是“保持酸性做透析的样品”与“透析到中性的样品”之间的比较。既然论文自己的表述和方法的记述彼此不一致，下面我会沿用论文的叫法，但请带着这一点来读。机制的主角终究是pH移动带来的去质子化，而不是“有没有做透析”。

在 pH 4.0（论文所说的“透析前”） 下，可以看到3个群体。

• 亲脂性的mRNA复合体 34%（TMR＋Cy5＋。带着相当多的辅助脂质）
• 非亲脂性的mRNA复合体 25%（TMR−Cy5＋。几乎不带辅助脂质，是mRNA与可电离脂质形成的强带电团块）
• 空的LNP 41%

到了 pH 7.4（透析后），情况就完全变了。

• 装有mRNA的LNP 23%
• 空的LNP 77%
• 没有被包裹的裸露mRNA 只占全部事件的 4%

请注意这里有两种不同的分母。23%／77% 是以“TMR发了光的事件＝脂质颗粒”为分母的比例，而 4% 是以“检测到的全部事件”为分母的比例（论文图2的说明文字里就是这么写的）。前两者相加正好是100%，原因就在这里；裸露的mRNA并不包含在那里面。

接着是装载量。装有mRNA的LNP的个数平均是 2.80 ± 0.41 条，众数是 2条，大约四分之三落在1〜3条（n = 6，独立的制剂实验）。在pH 4.0下，亲脂性复合体是 3.43 ± 0.38 条，非亲脂性复合体是 1.34 ± 0.20 条，整体是 2.51 ± 0.24 条。

补充性的实测值也齐备。粒径（动态光散射的z平均）在 pH 4.0 下是 106.3 ± 13.0 nm，在 pH 7.4 下是 120.5 ± 6.0 nm。Zeta电位从 +45.1 ± 0.9 mV 变到 −6.3 ± 1.3 mV。包封效率用 RiboGreen 测是 94.2% ± 3.6%，从CICS的计数求得则是 85.6% ± 5.1%。

作者们还证明了3色判别确实是必要的。如果不使用YOYO-1、只做2色判别，最多会有10.4%的事件被误判成装有mRNA的LNP。多花的这份功夫是有意义的。

② 为什么空载会增多——透析过程中颗粒会“裂开，又粘上”

pH 4.0下空的LNP是41%，而pH 7.4下是77%。是增多了。 作者们从这里读出了组装的机制。

关键是 PEG脂质决定了“颗粒大小的上限” 这一先行认识。PEG有它占据界面的面积，所以在其他脂质量相同的情况下，PEG占比越高，就只能提高表面积／体积比＝把颗粒做小。实际上，把DMG-PEG从 0.25% 增加到 3%，pH 7.4下的平均粒径就从 210 nm 缩到了 100 nm。而在 pH 4.0 下，改变PEG量，粒径和装载量都不变。也就是说，变化全都发生在透析过程中。

👦 学生：透析不就是把乙醇抽掉的操作吗。

🧬 艾克索太郎：这正是陷阱所在。透析让pH从4.0升到7.4，可电离脂质就失去正电荷。在pH 4.0下靠“电荷排斥＋PEG”维持稳定的颗粒，到了pH 7.4就必须只靠“PEG”来稳定。 支撑方式变了，颗粒就会重新组装形状。而且这时候，还必须从 pH 4.0 的双层膜囊泡，转到 pH 7.4 的“由一层包住疏水内核”的结构。同样的脂质量却需要更大的表面积。所以颗粒大概会裂开吧——这就是论文的推理路线（对于图4和图6的那套说法，论文自己明确写了是“假说（hypothesized）”）。

论文给出的说法是这样的。以下全部都是论文基于群体统计作为推论而提出的假说，并不是观察到了裂开的瞬间或融合的瞬间。

PEG较多时（1.5%以上）：空的LNP被认为是裂开之后增多的（依据是TMR的平均值下降、个数浓度上升这些观测事实）。初期装载量较多的亲脂性复合体中的一部分也裂开、装载量因此下降——论文是这样解释的。中等到低装载的那些则保持装载量。PEG非常多（3.0%以上）时裂开占优势，平均装载量下降而颗粒数增加。另一方面，原本不带辅助脂质的非亲脂性复合体，被推论为与空的LNP融合，从而接收到了辅助脂质（这是从透析后装载量分布变得比较整齐，以及原本不带TMR的群体获得了TMR这两点反推出来的）。

PEG较少时（1.0%以下）：大小的上限放宽，于是亲脂性复合体可以彼此融合——论文是这样想的。结果是装载量大幅增加。此时TMR信号的增幅一贯地大于mRNA装载量的增幅——这正是脂质是从空的LNP那里接收来的证据。

用实际数据对比起来更清楚。PEG 1.5% 时是 空41%→77%，PEG 0.5% 时是 空33%→81%。两者都是在透析之后空载增多了。

③ 降低N/P比，大小不变而装载量增加

下一个操作变量是N/P比。保持mRNA浓度不变，让所有脂质按可电离脂质的比例一起增减。因为PEG“对全部脂质的占比”不变，颗粒大小的上限也就不变。

可是在大小不变的情况下，降低N/P比，每一颗的装载量增加了。 道理在于库存比。N/P比下降＝脂质相对于mRNA变少＝变成空LNP的脂质减少。实际上，pH 4.0 下空的LNP的比例与N/P比呈现出很强的正相关（N/P = 12 时为 50%，N/P = 2 时为 15%）。

于是透析过程中会遇到谁就变了——这是论文的解释。N/P比高的话，周围全是空的LNP，所以装有mRNA的颗粒会与空的LNP融合（＝不增加mRNA，只接收脂质）而达到上限尺寸。N/P比低的话，周围都是mRNA复合体，于是带着mRNA的颗粒彼此融合。这两者都不是观察，而是从分布推导出来的说法。在达到同一个上限尺寸之前，装上去的货物数量就不一样了。

不过 pH 7.4 下空载的比例，即便降低N/P比也没有减少。 在低N/P比下，空的LNP的绝对数也减少，但由于装载量增加，装有mRNA的LNP的数目也随之减少。两者相抵，比例就不动了——论文是这样解释的。

④ 浓度不起作用，尺寸起作用——“装载量不是条数而是重量”

把mRNA浓度从 5 变到 100 µg/mL、相差20倍，脂质也按比例变化，结果粒径和装载量分布几乎都没有变（只有空载的比例，在最低浓度 5 µg/mL 时最低，20〜100 µg/mL 则几乎相同）。

这与高分子世界的常识不同。在pDNA与聚乙烯亚胺的复合体里，人们早就知道，提高核酸浓度会让装载量多的颗粒被动力学冻结。作者们的解释是，阳离子脂质比高分子阳离子动得快，所以能充分接触到mRNA，不容易把多条mRNA交联在一起。

反过来起作用的是 mRNA的长度。把1929 nt 换成 996 nt（差不多是一半），大小的上限不变，但平均装载量显著增加，众数在pH 4.0和7.4下都变成了 2倍。空载的比例在 N/P = 3 和 N/P = 6 两种情况下也都下降。

🧬 艾克索太郎：由此得出的一句话，是这篇论文最漂亮的结论。“具有某个大小上限的LNP，其装载容量不能用mRNA的条数来表示，而可以表示为某个确定的质量。” 既然货箱的容积是定的，那么货物小就能多装几件。有研究装载siRNA（约20 nt）时报告不存在空的LNP，这也是用同一个道理连起来的。

⑤ 加入空载颗粒之后，肝脏里的表达下降了

最后，他们确认这件事在体内是否有意义。除了 N/P = 3 和 N/P = 6 的处方（按论文的记述，两者的空载都约为75%。这与表2的基准值 77% ± 8% 稍有偏差，但两个数字都出自论文本身）之外，还准备了把 N/P = 3 做出来的LNP在事后混入空的LNP、使总N/P比变成6的“N/P = 3+3”（空载 86%）。这是一个不改变装有mRNA的LNP的数目、只把空载增加到约2倍的组。

他们装载荧光素酶mRNA，从 Balb/cJ 小鼠（雌性，8周龄）的尾静脉给予 0.5 mg mRNA/kg，12小时后腹腔注射D-荧光素并用IVIS成像，再取出器官做定量。

• 肝脏：在加入了空的LNP的组（N/P = 3+3）里，表达下降了（P = 0.0298，非配对双侧t检验，N/P = 3 与 N/P = 3+3 的比较）。而往肝脏的分布量本身并没有变化
• 脾脏：只有来自 N/P = 3 的2组（3 和 3+3）显示出有意义的表达，而N/P = 6 几乎没有表达（P = 0.0280）

一般认为，LNP聚集到肝脏，是由于与血液中的 载脂蛋白E（ApoE）的相互作用。作者们一方面提出了空的LNP与装有mRNA的LNP争夺ApoE的可能性，一方面谨慎地以“还需要进一步研究”收尾。

未来会怎样改变？（通往临床的路）

可以把“从颗粒这一侧看的指标”放进生产的质量管理里

最现实的用处就在这里。CICS是在流动中测量，所以样品量极少，每个处方20分钟就能处理5万个以上的事件（事件里也包含裸露的mRNA等其他种类）。论文还把它应用到了保存稳定性的评价上（补充图12）。

现在用于LNP制剂批次判定的指标是粒径、多分散指数、Zeta电位和包封效率。如果在这里再加上 “空载率”和“每一颗的装载量分布”，会变成什么样呢。即便是同样包封效率94%的批次，空载率为77%的和为50%的，在给予同样mRNA量时被带进去的脂质总量是不同的。也就是说，为了得到同样的疗效所要背负的脂质负荷，可以作为指标来管理。

“减少空载”这个优化方向显现出来了

这篇论文把“转哪个旋钮会让什么动起来”整理清楚了。PEG量决定颗粒大小的上限，脂质与mRNA的质量比决定“最初形成的mRNA复合体与空的LNP之间的分配”，而透析过程中的裂开与融合把这件事收尾。 浓度不起作用。货物小，空载就减少。

👦 学生：那么，做出空载为零的LNP不就好了吗。

🧬 艾克索太郎：有意思的地方恰恰在于它并不这么简单。 为了减少空载而降低N/P比，每一颗的装载量就会增加，颗粒的数目就会减少。在这篇论文的动物实验里，N/P = 6 在脾脏几乎没有表达，N/P = 3 则表达了。 装载量多的少数颗粒，和装载量少的多数颗粒，即便总mRNA量相同，在体内的行为也不一样。想送到哪里，最优解就会跟着变。 空载率不该读成“应该减小的恶”，而该读成设计上的一个自由度。

另一方面，坦率地说，离临床还很远

这篇论文里没有临床数据。小鼠实验也只是单次给药·12小时的单一时间点·只看肝脏和脾脏·报告基因。反复给药、免疫应答、治疗用蛋白质的表达、人体内的药代动力学都在范围之外。而且正如下一节会写的，被测量的处方并不是现行疫苗的处方。

该怎样批判性地读这项研究（局限，以及进一步提高质量的路）

可以肯定的地方

我公平地写。测量的设计是正确的。 用光片覆盖整个截面、把检测效率拉齐的构想，用3色同时亮灯来判别3个种类的设计，以及实测单条裸露mRNA的分布并把它当作基底的想法，全都朝着“不含糊的计数”的方向。由于把透析前后两种状态都测了，静态的描述变成了关于机制的讨论。自己定量出2色最多可能误判10.4%这件事，这也很诚实。用正交的方法做了印证——他们用超分辨共聚焦显微镜观察固定在树脂里的LNP，通过另一条路径确认了空载确实很多。还有，代码可按请求提供，源数据也作为附件给出。对可重复性的态度是良好的。

需要留意着读的地方

① 这不是对现行mRNA疫苗的测量。 这是最容易被误解的一点，所以放在最前面。所用的可电离脂质是 DLin-MC3-DMA（在siRNA药物 patisiran 上已实用化的脂质），而不是新冠疫苗的 ALC-0315（BNT162b2）或 SM-102（mRNA-1273）。mRNA也是把尿苷的25%替换成Cy5标记体的市售染料标记mRNA，与疫苗里使用的N1-甲基假尿苷修饰mRNA是两回事。透析也是实验室规模的12小时批次操作，与工业上的切向流过滤不同。把它概括成“疫苗的八成都是空颗粒”，作为对这篇论文的读法是错误的。

② 没有给出荧光是线性的保证。 去卷积完全依赖于“装了n条的颗粒的亮度是单条分布的 n 倍”这一假定。可是染料一旦密集就会自猝灭，距离近了还会发生能量转移。在多条mRNA被挤进脂质内核的状态下，Cy5究竟是不是真的亮n倍，论文没有验证。如果存在猝灭，装载量就会被低估。要是有封入了已知量mRNA的对照，或者有查验猝灭有无的实验，这个假定就会牢固得多。

③ 颗粒数浓度的单位对不上。 表2里装有mRNA的LNP的个数浓度写的是 1.29 × 10¹⁶ ± 2.22 × 10¹⁵ mL⁻¹。可是从投入的mRNA量来估算，mRNA 20 µg/mL、1929 nt（分子量大约 6.4 × 10⁵）约为 1.9 × 10¹³ 分子/mL，若包封效率85.6%、每颗2.80条，就是 6 × 10¹² 颗/mL 左右。记载的数值要大约2,000倍。即便假设单位是 L⁻¹，仍会残留约2.2倍的偏差，所以也并不能断定这是单位的笔误。计算的细节在补充资料（Supplementary Discussion 2〜5）里，正文中追不到，因此我不下定论；但只读正文就去引用数字，是会把数量级搞错的。另外，空载与装有mRNA之比（4.88 × 10¹⁶ 对 1.29 × 10¹⁶ ≒ 79% 对 21%）与77%／23%是一致的，作为比例来读是没有问题的。

④ 正文里有一句自相矛盾的话。 在论证了3色判别是必要的之后，紧接着就写道“因此，为了在装载量的分布与容量的计算中得到更高的精度，采用了2色判别法”。从上下文来看，把它读成“采用了3色判别”的笔误是自然的，但究竟是用哪一种方法得出主要结果，在正文里无法确定，这对一篇以计数为卖点的论文来说很要命。同样地，激光波长在结果一节里是 647 nm，在方法一节里是 640 nm，彼此矛盾（从产品名看，640 nm是正确的）。图7的说明文字也把肝脏的结果指为“面板 i”，而本来应该是 面板 l。这些都不会颠覆结论，但都是本该在校对阶段消灭掉的瑕疵。

⑤ “透析前”这个叫法与方法一节矛盾。 上面提到的这一点，我在这里作为局限再列一次。表2把 pH 4.0 的样品称为“透析前（＝最初的LNP）”，但方法一节明确写了 pH 4.0 的样品也透析了12小时（对着乙酸缓冲液，为的是除去乙醇）。被比较的不是“有没有做透析”，而是“透析到哪个pH”。 论文的主张——pH升高发生去质子化，颗粒就会重新组装——在这个更正之后也不会动摇；但如果把“透析前”这个词按字面接受，就会误以为测的是还残留着乙醇的颗粒。表和方法里的用词本该统一。

⑥ 所谓“机制”基本上是假说。 图4和图6里裂开·融合的那套说法，正如论文自己写的 hypothesized、presumably 那样，是从群体统计（比例、TMR的几何平均、个数浓度）得出的推论。他们并没有以时间分辨的方式观察到单个颗粒裂开／融合的瞬间。虽然有“与先行的FRET和冷冻电镜的报告相吻合”这样的佐证；但是，“应该是这样的”与“就是这样的”之间的距离依然留着。

⑦ n 偏小，对否定性结论支撑不足。 大多数条件都是 n = 3（只有基准处方是 n = 6）。要用 n = 3 去主张“浓度不影响装载量”“mRNA尺寸不影响上限尺寸”这类没有差异的结论，还是希望看到等效性的设计和检验效能的说明。

⑧ 包封效率的两个数值之间没有填平。 对于 RiboGreen 94.2% 与 CICS 85.6% 之间约9个百分点的差距，论文只是并列呈现，没有讨论原因。哪一个更接近真实，这个差是来自检测效率还是来自染料的可及性，都直接关系到计数本身的可信度。

⑨ 动物实验的解释里有混杂。 N/P = 3+3 组是加入了空的LNP的组。也就是说，被给予的脂质总量也增加了。如果要用争夺ApoE来解释肝脏里表达的下降，就需要把脂质总量拉齐的对照（例如用等量的无关脂质体代替空的LNP加进去的组）。作者们避免下定论是恰当的；不过，“空载在捣乱”这样的读法，仅凭这些数据是无法确定的。 另外还有 n = 3〜4、12小时的单一时间点、只用雌性、只用1个品系。

⑩ 测的是“稀释之后、静置1小时以上之后”的状态。 CICS要先稀释、与YOYO-1在暗处孵育1小时以上，再花20分钟测量。LNP不是处于平衡状态的坚硬构造体，所以在测量的前处理过程中状态是否发生了移动，本来是想确认一下的（他们测了保存稳定性是好兆头，但那并不是对前处理本身的验证）。

⑪ 装载量与功能之间没有连起来。 即便知道了“一颗里有几条”，它与内体逃逸或翻译量是怎么联系的，论文并没有测。装了2条的颗粒和装了8条的颗粒，当一颗进入细胞时蛋白质产量会差几倍。只有把这里填平，空载率才算作为设计指标真正完成。

怎么做才能成为质量更高的研究

• 加入对猝灭的验证。 用封入了已知拷贝数mRNA的标准颗粒，或者用改变了Cy5标记率的mRNA来确认线性。去卷积的地基就会变牢
• 对现行疫苗处方（ALC-0315、SM-102）做同样的测量。 这是本研究最大的外推对象，也是读者最想知道的数字
• 把数值和单位做机械式的逐一核对。 颗粒数浓度的单位、2色/3色的记述、激光波长、图的引用对象，都能用投稿前的检查清单消灭掉
• 直接观察机制。 用停流＋时间分辨FRET，或者能追踪透析过程的微流道，实时捕捉裂开与融合
• 在动物实验里把脂质总量拉齐。 如果要主张空的LNP的作用，就需要脂质量一致的对照组。还有给药后的时间进程和多个器官
• 在单细胞水平上把装载量与表达量联系起来。 分别做出装载量整齐的颗粒，同时测量摄取数与蛋白质产量

艾克索太郎的视角

通讯作者在研究和我一样的疾病

我老实说。mRNA-LNP的制剂物理化学，并不是我本来的专业。 我所从事的，是用间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）以及从它们那里释放出来的细胞外囊泡（extracellular vesicle, EV），来治疗以脊髓损伤为首的神经疾病。

即便如此，我选这篇论文的理由之一，是通讯作者 Mao 的实验室确实在做脊髓损伤的再生医学。如前所述，Biomaterials 2020年把纳米纤维—水凝胶复合体注入大鼠脊髓挫伤，以及 Cells 2022年把MSC与那个复合体组合起来做的脊髓损伤治疗。逐个清点纳米颗粒的研究，和把MSC送到损伤脊髓的研究，在同一个屋顶之下。 我想这不是偶然。两者都是“对运输工具的内容，我们究竟了解到什么程度”这同一个问题的两端。

最沉重的教训——我们太多地用平均值在说话

这篇论文摆在我面前的，既不是方法也不是数字，而是提问的方式。

请回想一下我们在EV论文里写的那些数字。用纳米颗粒跟踪分析得出“每1 mL有多少个颗粒”。在另一支试管里提取RNA，得出“多少 ng 的RNA”或者“这个miRNA有多少拷贝”。然后做个除法，说“每一颗有多少拷贝”。

这恰恰就是这篇论文所指出的、“靠平均值是弄不清楚的”那个批量平均装载量。把群体的总量除以群体的个数得到的平均值。它并没有回答“哪一颗里装了几条”。（为免误解——这与包封效率是两回事。包封效率是“投入的mRNA里有几成被包了起来”这样一个mRNA侧的比例，并不是用除法算出来的每一颗里有几条。这篇论文推翻掉的，是“用平均值来说话”这一侧。）

EV领域里早已有过警告。Chevillet 等人在 PNAS 2014年第111卷第41号14888页上，对外泌体的miRNA含量做了定量的、化学计量学的分析，报告说单个外泌体的大半都没有携带生物学上有意义的数目的miRNA。对于那些按每颗取平均会低于0.01拷贝的特定miRNA，“平均0.01拷贝”的意思不是“每一颗里都有0.01个”，而是“绝大多数颗粒是空手的，只有极少一部分带着1个以上”（仅凭平均值并不能确定分布的形状，所以不能断言“每100颗里正好有1颗带1个”）。这与LNP里77%是空载的，在结构上是同一回事。

我把这写成自己的反省。当我把MSC-EV的治疗效果归因于某个特定的miRNA时，实际带着那个miRNA的颗粒在整体中占多少%，我并没有测过。 这篇论文的作者们在合成颗粒上做到的事，我们在生物来源的颗粒上还做不到。

不过，数字搬不过来——能搬过来的只有问题

这里我要写得谨慎些。LNP与EV是不同的东西。LNP是设计出来再组装的合成颗粒，组成已知，尺寸分布也能控制。EV是生物做出来的，所以每一颗都不一样，膜里嵌着四跨膜蛋白之类的膜蛋白，表面还覆盖着一层蛋白质。“77%是空载”这个数字能套用到EV上的根据，哪里都没有。

能搬过来的是问题和方法论。而实际上，方法论这一侧意外地近。CICS是“让颗粒在毛细管里排成一列流过，用多种颜色的同时亮灯来分类，再以已知的单分子分布为基底来估计数目”的技术。EV领域里正在铺开的单囊泡分析（single-EV analysis），以及用流道实现的高灵敏度流式细胞术，都处在同样的构想、同样的方向上。

👦 学生：那么，在EV上也做同样的事就好了吧。

🧬 艾克索太郎：应该做，我也想做。不过要附上一条从这篇论文学到的自我警醒。这篇论文能把主张立得最硬，是因为把透析前和透析后都测了。 如果只测成品，就只会停在“八成的颗粒是空载”这一个事实上，够不到“为什么会这样”。EV也一样，只测从培养上清里回收的成品，为什么会形成那样的分布，这一辈子都弄不清。 细胞把货装进EV的阶段、释放的阶段、回收与纯化的阶段——哪里决定了什么，必须按工序逐一去测。我们现在几乎只在测成品。

送达目标之间的距离，还没有被填平

最后，作为我自己的课题。这篇论文的动物实验展示的是往 肝脏和脾脏 的递送。它们是静脉注射的纳米颗粒最容易到达的器官，而且还搭上了ApoE这一已知的机制。而我想送达的，是在血脑屏障和血脊髓屏障另一侧的、受了损伤的神经组织。

能准确数出颗粒的内容，和那颗颗粒能不能送达，是两个不同的问题。 不过就顺序而言，数不出来的东西是无法优化的。正因为有了“每一颗2条”这个数字，“那么需要多少颗”“会让它背上多少脂质”这样的讨论，才终于从推测变成了计算。

而且我信任这篇论文本身的写法。他们在自己的机制说明里写了“hypothesized”“presumably”，在动物实验的解释里写了“还需要进一步研究”。 不把测到的和推测的混在一起。朴素，但我认为这是一篇以计数为卖点的论文应有的态度。

另外，本文与同日公开的“mRNA疫苗的“增强剂”不是内容，而是容器”是成对的内容。这一篇讲的是“LNP的大半都是空载”，那一篇讲的是“恰恰是那些空载的颗粒引起了天然免疫”。两篇对照着读，会更有意思一层。

※本文在人工智能的协助下撰写。