mRNA ढोने वाले लिपिड नैनोपार्टिकल को एक-एक कण गिना तो — लदी mRNA औसतन 2.8 अणु, और 80% कण “ख़ाली” दौड़ रहे थे

लिपिड नैनोपार्टिकल (lipid nanoparticle, LNP) एक वाहक है जो नाज़ुक mRNA को लिपिड के कण में लपेटकर कोशिका के भीतर तक पहुँचाता है। mRNA वैक्सीन के साथ यह एक झटके में व्यवहार में आ गया, और अब जीन-संपादन के औज़ार यकृत तक पहुँचाने वाले इलाज में भी इस्तेमाल हो रहा है।

यहाँ एक सीधा-सा सवाल पूछता हूँ। उस एक कण में mRNA के कितने अणु भरे होते हैं?

तुरंत उत्तर दे सकने वाले लोग लगभग नहीं मिले। फॉर्मुलेशन की गुणवत्ता-सूचना में जो आँकड़ा आता है, वह “एनकैप्सुलेशन एफिशिएंसी (encapsulation efficiency, EE) 94%” जैसा होता है। इसका अर्थ है “डाली गई mRNA में से 94% कण के भीतर चली गई” — यानी यह mRNA की तरफ़ से देखा गया अनुपात है। कण की तरफ़ से उठने वाले सवालों — “प्रति कण कितने अणु”, “कितने कण ख़ाली हाथ हैं” — का इसमें एक शब्द का भी उत्तर नहीं है।

आज जो पेपर ले रहा हूँ, वह 2022 का Nature Communications का वही शोध-पत्र है जिसने उस सवाल का उत्तर एक-एक कण गिनकर दिया। निष्कर्ष पहले ही लिख देता हूँ। प्रयोगशाला के मानक फ़ॉर्मुलेशन वाले LNP में, mRNA लदे कणों के भीतर प्रति कण औसत 2.80 अणु रहा, और सबसे आम मान 2 अणु। और कुल कणों में से 77% ने mRNA का एक भी अणु नहीं लादा था।

2 बातें पहले ही स्पष्ट कर दूँ। पहली, यह 2022 का पेपर है। फिर भी इसे चुनने की वजह यह है कि यहाँ निकला “ज़्यादातर कण ख़ाली हैं” वाला आँकड़ा, मेरी नज़र में, उसके बाद इस क्षेत्र के बारे में सोचने का शुरुआती बिंदु बन गया, और नापने की जो सोच इसमें है वह हमारी बाह्यकोशिकीय पुटिका (extracellular vesicle, EV) वाली शोध पर सीधे-सीधे लागू होती है। दूसरी, जो नापा गया वह बाज़ार से ख़रीदी गई रंजक-चिह्नित mRNA और आयनीकरणीय लिपिड के तौर पर DLin-MC3-DMA इस्तेमाल करने वाला “पाठ्यपुस्तकीय” प्रयोगशाला फ़ॉर्मुलेशन था। यह नए कोरोना वायरस की वैक्सीन को ही नापने वाला पेपर नहीं है। इन दोनों को मिलाकर न पढ़ें।

पत्रिका की जानकारी

• शोध-पत्र का शीर्षक: Payload distribution and capacity of mRNA lipid nanoparticles (mRNA लिपिड नैनोपार्टिकल के लदान का वितरण और क्षमता)
• शोध-पत्र का प्रकार: मूल शोध-पत्र (माप-तकनीक का विकास + फॉर्मुलेशन का भौतिक रसायन)
• पत्रिका: Nature Communications 2022, खंड 13, लेख संख्या 5561 (13 जनवरी 2022 को प्राप्त, 5 सितंबर को स्वीकृत, 23 सितंबर को ऑनलाइन प्रकाशित)
• DOI / लिंक: 10.1038/s41467-022-33157-4
• लाइसेंस: ओपन एक्सेस (CC BY 4.0)। पूरा पाठ कोई भी पढ़ सकता है
• Impact Factor: अनुमानतः लगभग 15 (वर्ष-दर-वर्ष बदलता रहता है। सामान्य विज्ञान की पत्रिकाओं में भी यह सबसे ऊपरी श्रेणी में से एक है)
• लेखक: Sixuan Li, Yizong Hu (ये 2 संयुक्त प्रथम लेखक हैं), Andrew Li, Jinghan Lin, Kuangwen Hsieh, Zachary Schneiderman, Pengfei Zhang, Yining Zhu, Chenhu Qiu, Efrosini Kokkoli, Tza-Huei Wang, Hai-Quan Mao — कुल 12 लेखक
• संस्थान: सभी जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय (मेरीलैंड, बाल्टिमोर, अमेरिका)। यांत्रिक अभियांत्रिकी विभाग, नैनोबायोटेक्नोलॉजी संस्थान (INBT), चिकित्सा संकाय का जैव-चिकित्सा अभियांत्रिकी विभाग, Translational Tissue Engineering Center, रसायन एवं जैव-आण्विक अभियांत्रिकी विभाग, सामग्री-विज्ञान एवं अभियांत्रिकी विभाग
• संगत लेखक: Yizong Hu, Tza-Huei Wang, Hai-Quan Mao — ये 3 (Wang और Mao के बारे में स्पष्ट लिखा है कि वे “संयुक्त संगत लेखक के रूप में समान योगदान” रखते हैं)
• वित्त-पोषण: अमेरिकी राष्ट्रीय एलर्जी एवं संक्रामक रोग संस्थान (NIAID) के अनुदान U01AI155313 (Mao) और R01AI137272 (Wang)
• हितों के टकराव की घोषणा: Li, Hu, Wang और Mao — ये 4 लेखक इस पेपर की तकनीक को लेकर पेटेंट आवेदन कर चुके हैं (जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय के Office of Technology Ventures के ज़रिए)। बाक़ी लेखकों की कोई घोषणा नहीं है
• समकक्ष समीक्षा: Nature Communications की नीति के अनुसार समीक्षा-रिपोर्ट सार्वजनिक है, और समीक्षकों में से एक के रूप में Xucheng Hou का नाम उजागर किया गया है

संगत लेखक किस तरह के शोधकर्ता हैं

Hai-Quan Mao जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय के नैनोबायोटेक्नोलॉजी संस्थान (INBT) के प्रमुख हैं, और साथ ही सामग्री-विज्ञान एवं अभियांत्रिकी विभाग तथा चिकित्सा संकाय के जैव-चिकित्सा अभियांत्रिकी विभाग, दोनों में प्रोफ़ेसर भी। उनका सफ़र कुछ अलग ढंग का है: चीन के वुहान विश्वविद्यालय से रसायन-शास्त्र में स्नातक (1988) और बहुलक रसायन में डॉक्टरेट (1993), उसी विश्वविद्यालय में व्याख्याता रहने के बाद 1995–1998 में जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय में पोस्टडॉक। 1999–2003 में Johns Hopkins Singapore के सह-शोध प्रमुख, 2001–2003 में सिंगापुर राष्ट्रीय विश्वविद्यालय में सहायक प्रोफ़ेसर का अतिरिक्त दायित्व, और 2003 में जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय के Whiting School of Engineering में शिक्षक बने। 2016 में INBT के उप-निदेशक बने और अब निदेशक हैं। ब्रिटेन की रॉयल सोसाइटी ऑफ़ केमिस्ट्री के फ़ेलो (2014), अमेरिकन इंस्टिट्यूट फ़ॉर मेडिकल एंड बायोलॉजिकल इंजीनियरिंग (AIMBE) के फ़ेलो (2018), और नेशनल अकेडमी ऑफ़ इन्वेंटर्स (NAI) के फ़ेलो (2023)।

उनके शोध के 2 स्तंभ हैं। एक है flash nanocomplexation (FNC) नामक वह तरीक़ा जिसने न्यूक्लिक अम्ल या प्रोटीन को बहुलक के साथ मिलाकर नैनोकण बनाने की प्रक्रिया को स्केल-अप करने योग्य बना दिया। दूसरा है नैनोफ़ाइबर-हाइड्रोजेल कंपोज़िट (nanofiber-hydrogel composite, NHC) — इलेक्ट्रोस्पिनिंग से बनी पॉलीकैप्रोलैक्टोन (PCL) की नैनो-रेशों के टुकड़ों को हायल्यूरॉनिक अम्ल की जेल-जाली में सहसंयोजक बंध से बुन दिया गया, एक इंजेक्ट किया जा सकने वाला मचान-पदार्थ।

यह बात मेरे लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए पहले ही लिख देता हूँ। Mao की यह प्रयोगशाला उस NHC को रीढ़ की हड्डी की चोट में इस्तेमाल करने का शोध असल में आगे बढ़ाती रही है। Biomaterials 2020, खंड 245, 119978 (प्रथम लेखक Xiaowei Li, अंतिम लेखक Mao) रैट के रीढ़-कुचलन (contusion) मॉडल में NHC इंजेक्ट करने वाला अध्ययन है; और Cells 2022, खंड 11, अंक 7, 1137 (प्रथम लेखक Agnes Haggerty, सह-लेखक Mao तथा Martin Oudega, ओपन एक्सेस) में अस्थि-मज्जा से प्राप्त मेसेनकाइमल स्ट्रोमल सेल (mesenchymal stromal cell, MSC) को NHC के साथ जोड़कर क्षतिग्रस्त रीढ़ में इंजेक्ट किया गया है। यानी इस बार के पेपर का संगत लेखक वह व्यक्ति है जो mRNA-LNP का भौतिक रसायन और MSC × रीढ़ की चोट की पुनर्योजी चिकित्सा, दोनों एक ही प्रयोगशाला में करता है। आगे के हिस्से में इस बात पर लौटूँगा।

Tza-Huei (Jeff) Wang उसी विश्वविद्यालय के यांत्रिक अभियांत्रिकी विभाग में Louis M. Sardella प्रोफ़ेसर हैं (2021 में स्थापित दान-पीठ), जैव-चिकित्सा अभियांत्रिकी विभाग में भी उनका अतिरिक्त दायित्व है, और वे BioMEMS and Single Molecule Dynamics Lab के प्रमुख हैं। कैलिफ़ोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजेलिस (UCLA) से यांत्रिक अभियांत्रिकी में डॉक्टरेट (2002) लेकर उसी वर्ष जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय में नियुक्त हुए, और जुलाई 2013 से पूर्ण प्रोफ़ेसर हैं। AIMBE फ़ेलो (2017; नैनो-बायोसेंसर तथा एकल-अणु संसूचन के सहारे आनुवंशिक एवं एपिजेनेटिक रोगों के विश्लेषण में योगदान के लिए चुने गए)। शोध-पत्र 150 से अधिक, पेटेंट 20 से अधिक।

इस पेपर की केंद्रीय तकनीक स्वयं Wang की प्रयोगशाला का आविष्कार है। मुख्य पाठ में इस्तेमाल हुई CICS (cylindrical illumination confocal spectroscopy, बेलनाकार प्रदीपन सहसंकेंद्री स्पेक्ट्रोस्कोपी) उसी प्रयोगशाला द्वारा Biophysical Journal 2008, खंड 95, पृष्ठ 2964 पर प्रकाशित तरीक़ा है। उनका आम विषय है तरल बायोप्सी (रक्त में मौजूद सूक्ष्म मात्रा की DNA) के मेथिलीकरण को digital high-resolution melting से पढ़कर कैंसर का शीघ्र पता लगाना, और “बहुत थोड़े-से अणुओं को एक-एक कर सही-सही गिनना” — यही एक बिंदु इस बार के LNP विश्लेषण से साझा है।

संयुक्त प्रथम लेखक और संगत लेखक, दोनों की भूमिका निभाने वाले Yizong Hu ही, लेखक-योगदान खंड के अनुसार, इस शोध की कल्पना करने वाले व्यक्ति हैं। त्सिंगहुआ विश्वविद्यालय से बहुलक-सामग्री में स्नातक (2016), जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय से जैव-चिकित्सा अभियांत्रिकी में डॉक्टरेट (2022)। सार्वजनिक प्रोफ़ाइल के अनुसार उसके बाद वे मैसाचुसेट्स इंस्टिट्यूट ऑफ़ टेक्नोलॉजी (MIT) में पोस्टडॉक के रूप में ग़ैर-वायरल जीन-डिलीवरी पर शोध कर रहे हैं।

आख़िर अब तक क्या पता नहीं था?

”एनकैप्सुलेशन एफिशिएंसी 94%” जिस सवाल का उत्तर नहीं देती

LNP की गुणवत्ता की बात हो तो एनकैप्सुलेशन एफिशिएंसी ज़रूर सामने आती है। नापने का तरीक़ा सीधा है: RiboGreen जैसे ऐसे रंजक का इस्तेमाल होता है जो न्यूक्लिक अम्ल से जुड़कर चमकता है, और “सर्फ़ैक्टेंट से कण तोड़ने से पहले” तथा “तोड़ने के बाद” की प्रतिदीप्ति की तुलना की जाती है। तोड़ने से पहले केवल बाहर पड़ी mRNA चमकती है, तोड़ने के बाद सारी चमकती है। इस अंतर से निकलता है कि “कितने % कण के भीतर थी”।

👦 छात्र：94% तक भर गई है, तो इतना काफ़ी लगता है।

🧬 एक्सोतारो：नहीं, सवाल ही दूसरा है। यह तो सामान की हाज़िरी है। यह कह रहा है कि “भेजे गए 100 पार्सल में से 94 ट्रक पर लद गए”। पर हम जो जानना चाहते हैं वह ट्रक की तरफ़ की बात है — “ट्रक कितने दौड़ रहे हैं, एक ट्रक पर कितने पार्सल हैं, और कितने ट्रक ख़ाली दौड़ रहे हैं”। हाज़िरी से यह कभी पता नहीं चलेगा।

यह शब्दों का खेल नहीं है। प्रति कण लदान पता चल जाए तो कणों की संख्या पता चलती है। कणों की संख्या पता चले तो यह चर्चा हो सकती है कि एक कोशिका को कितने कण निगलने पर असर होगा। और अगर ख़ाली कण ज़्यादा हैं, तो इसका अर्थ है कि असर में कोई योगदान न देने वाला लिपिड मरीज़ को दिया जा रहा है। लिपिड स्वयं प्रतिरक्षा को उत्तेजित करता है और यकृत पर बोझ डालता है, यह पता है — इसलिए यह बात सुरक्षा से भी सीधे जुड़ी है।

क्यों कोई इसे नाप नहीं पाया

मौजूदा माप-विधियाँ, सब में एक क़दम की कमी रह जाती थी।

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (cryo-TEM) से कण सीधे देखे जा सकते हैं। पर शरीर-क्रियात्मक pH 7.4 पर आयनीकरणीय लिपिड अपना आवेश खो देता है और कण के केंद्र में जलविरोधी, अक्रिस्टलीय कोर बना देता है, इसलिए mRNA भीतर हो या न हो, कण एक जैसा काला और भरा हुआ दिखता है। इस पेपर में भी mRNA के बिना बनाए गए ख़ाली LNP की तस्वीरें हैं, पर उन्हें पहचाना नहीं जा सकता।

लघु-कोण न्यूट्रॉन प्रकीर्णन, NMR और नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) भी उसी दीवार से टकराते हैं। कण का आकार और औसत संरचना तो निकल आती है, पर एक-एक कण के बारे में “भीतर कुछ है / नहीं है” का फ़ैसला नहीं हो पाता।

इसलिए लेखकों ने प्रतिदीप्ति को चुना। पर साधारण माइक्रोस्कोप से काम नहीं चलता। ज़रूरत एक ऐसे उपकरण की थी जो कणों को लगभग बिना छोड़े एक-एक कर गुज़ारे, और दर्ज करे कि कौन-कौन से रंग एक साथ चमके (पेपर के शब्दों में “द्रव्यमान-संसूचन दक्षता लगभग 100%”)।

CICS — केशनली के “टिकट-गेट” से एक-एक कण गुज़ारना

CICS की सोच इस तरह है। 10 µm के भीतरी व्यास वाली, बाल जितनी बारीक क्वार्ट्ज़ केशनली में दबाव (आर्गन गैस 42 psi) से नमूना बहाया जाता है। प्रवाह-वेग 1 mm/सेकंड। उसमें 3 लेज़र (488 nm, 552 nm, 640 nm) को बीम-कंबाइनर से एक में बाँधकर, बेलनाकार लेंस से चौड़ाई में फैली हुई “प्रकाश की चादर” के रूप में डाला जाता है।

👦 छात्र：साधारण बिंदु की जगह चादर क्यों?

🧬 एक्सोतारो：टिकट-गेट को पूरी चौड़ाई में ढकने के लिए। लेज़र को बिंदु पर समेट दें तो केवल केशनली के बीच से गुज़रा कण तेज़ चमकेगा और किनारे से गुज़रा कण मंद रहेगा। ऐसे में “मंद कण” और “कम भरे कण” में फ़र्क़ नहीं किया जा सकता। प्रकाश की चादर से पूरा अनुप्रस्थ काट ढक दें, तो कण कहीं से भी गुज़रे, उतनी ही चमक देगा। पेपर इसे द्रव्यमान-संसूचन दक्षता लगभग 100% कहता है। यानी सब टिकट-गेट से गुज़रते हैं, और सब एक ही शर्त पर।

संसूचक हैं एकल फ़ोटॉन गिनने वाले 3 एवलांश फ़ोटोडायोड (APD)। 0.1 मिलीसेकंड के अंतराल पर दर्ज करते हुए, प्रति फ़ॉर्मुलेशन 20 मिनट में 50,000 से अधिक इवेंट (प्रति मिनट 3,000–5,000 इवेंट) इकट्ठा किए जाते हैं।

और 3 रंगों के चिह्न अलग-अलग कामों के लिए बरते जाते हैं।

इन 3 रंगों के एक साथ जलने के संयोजन से 3 किस्मों की पहचान होती है।

• mRNA वाला LNP = YOYO-1 (−), TMR (+), Cy5 (+)
• ख़ाली LNP = केवल TMR (+)
• बिना लिपटी नंगी mRNA = YOYO-1 (+), Cy5 (+), TMR (−)

“1, 2 या 3 अणु” — यह कैसे गिना गया

यह इस पेपर का सबसे कारीगरी वाला हिस्सा है। Cy5 की चमक मोटे तौर पर “mRNA के कितने अणु हैं” से तय होती है, पर साथ ही वह प्रति अणु Cy5 की संख्या के बिखराव, फ़ोटॉन के उत्सर्जन तथा संसूचन के पॉयसों-सदृश उतार-चढ़ाव, और लेज़र की शक्ति या प्रवाह-वेग के घटाव-बढ़ाव से भी प्रभावित होती है। इसलिए “यह कण चमकीला है, तो इसमें 3 अणु हैं” — ऐसा एक-एक कण के बारे में ठोककर नहीं कहा जा सकता।

लेखकों ने इसकी जगह वितरण को सुलझाने वाला रास्ता लिया (डीकॉन्वोल्यूशन)।

1. पहले नंगी mRNA के 1 अणु की चमक का वितरण प्रत्यक्ष नापा जाता है (पेपर इसे D(RNA,1) लिखता है)
2. उस वितरण की चमक को n गुना कर दें, तो “ठीक n अणु वाले कण” का वितरण D(RNA,n) बन जाता है
3. नापे गए LNP के वितरण को D(RNA,1), D(RNA,2), … के भारित योग से फिर बनाया जा सके — इसके लिए भार w(n) समंजित किए जाते हैं
4. भारों का सर्वोत्तम समुच्चय ही सीधे “1 अणु वाले कितने %, 2 अणु वाले कितने %…” का उत्तर बन जाता है

अनुकूलन MATLAB की सिम्युलेटेड एनीलिंग (annealing) विधि से किया गया, और भारों का योग नापे गए कुल कण-संख्या से 1% से अधिक न हटे, इसके लिए दंड-गुणांक α = 0.1 लगाया गया। विचार में लिए जाने वाले लदान की ऊपरी सीमा, औसत लदान के आकलन (mRNA वाले LNP और नंगी mRNA की प्रतिदीप्ति के गुणोत्तर माध्यों का अनुपात) का 6 गुना रखी गई।

👦 छात्र：“एक-एक कण गिनना” कहते हुए भी, आख़िर में यह वितरण का आकलन ही है न?

🧬 एक्सोतारो：पैनी नज़र। “भीतर कुछ है / नहीं है” का फ़ैसला एक-एक कण पर होता है, और “कितने अणु” यह आबादी के स्तर पर किया गया आकलन है। यह फ़र्क़ ठीक-ठीक समझ लेना चाहिए; आगे आलोचनात्मक पड़ताल में इसे फिर छुऊँगा।

इस पेपर से क्या पता चला?

① मानक फ़ॉर्मुलेशन के नापे गए आँकड़े — 77% ख़ाली थे

नापा गया वह बेंचमार्क फ़ॉर्मुलेशन है जो साहित्य में बहुत इस्तेमाल होता है। आयनीकरणीय लिपिड DLin-MC3-DMA, हेल्पर लिपिड DSPC, कोलेस्ट्रॉल, और PEG लिपिड DMG-PEG2000 को मोलर अनुपात 50:10:38.5:1.5 में। mRNA के रूप में 1929 न्यूक्लियोटाइड (nt) वाला Cy5-चिह्नित उत्पाद, अंतिम सांद्रता 20 µg/mL, N/P अनुपात 6 (आयनीकरणीय लिपिड के ऐमीन समूह और mRNA के फ़ॉस्फ़ेट समूह का मोलर अनुपात)। T-आकार के जोड़ में लिपिड का एथेनॉल-घोल प्रति मिनट 1 mL और mRNA का जलीय घोल प्रति मिनट 3 mL की दर से बहाकर मिलाया जाता है, और 3,500 आण्विक-भार कट-ऑफ वाली झिल्ली से 4 ℃ पर 12 घंटे डायलिसिस की जाती है।

निर्णायक बात यह है कि अम्लीय अवस्था में ही (pH 4.0) और उदासीन पर लौटा देने के बाद (pH 7.4) — दोनों नापे गए।

⚠️ एक शब्द-प्रयोग पर ध्यान देना ज़रूरी है। पेपर की तालिका 2 पहले वाले को “Before dialysis at pH 4.0 (डायलिसिस से पहले = शुरुआती LNP)” कहती है, पर विधि का खंड पढ़ें तो pH 4.0 का नमूना भी 12 घंटे डायलिसिस किया गया है — एसिटिक बफ़र के विरुद्ध, एथेनॉल निकालने के लिए। यानी सख़्ती से यह “डायलिसिस के पहले और बाद” की तुलना नहीं, बल्कि “अम्लीय अवस्था में ही डायलिसिस किया गया नमूना” और “उदासीन तक डायलिसिस किया गया नमूना” की तुलना है। पेपर की अपनी शब्दावली और विधि का विवरण आपस में टकराते हैं, इसलिए आगे मैं पेपर की ही संज्ञा बरतूँगा, पर आप यह बात ध्यान में रखकर पढ़ें। क्रियाविधि का असली नायक तो pH के खिसकने से होने वाला डीप्रोटोनेशन है, “डायलिसिस हुई या नहीं” यह नहीं।

pH 4.0 पर (जिसे पेपर “डायलिसिस से पहले” कहता है) 3 आबादियाँ दिखीं।

• लिपोफ़िलिक mRNA कॉम्प्लेक्स 34% (TMR+ Cy5+; हेल्पर लिपिड काफ़ी मात्रा में मौजूद)
• गैर-लिपोफ़िलिक mRNA कॉम्प्लेक्स 25% (TMR− Cy5+; हेल्पर लिपिड लगभग नदारद — mRNA और आयनीकरणीय लिपिड का तेज़ आवेशित पिंड)
• ख़ाली LNP 41%

pH 7.4 पर (डायलिसिस के बाद) स्थिति पूरी तरह बदल जाती है।

• mRNA वाला LNP 23%
• ख़ाली LNP 77%
• बिना लिपटी नंगी mRNA कुल इवेंट का केवल 4%

ध्यान दें कि हर (denominator) 2 तरह के हैं। 23%/77% वे अनुपात हैं जिनका हर “वे इवेंट जिनमें TMR चमका = लिपिड के कण” है, और 4% वह अनुपात है जिसका हर “संसूचित किए गए सारे इवेंट” है (पेपर के चित्र 2 के विवरण में ऐसा ही लिखा है)। पहले दो को जोड़ने पर 100% बन जाता है, वजह यही है, और नंगी mRNA उसमें शामिल नहीं है।

और अब लदान। mRNA वाले LNP का संख्या-औसत 2.80 ± 0.41 अणु रहा, सबसे आम मान 2 अणु, और लगभग तीन-चौथाई कणों में 1–3 अणु थे (n = 6, स्वतंत्र फ़ॉर्मुलेशन प्रयोग)। pH 4.0 पर लिपोफ़िलिक कॉम्प्लेक्स में 3.43 ± 0.38 अणु, गैर-लिपोफ़िलिक कॉम्प्लेक्स में 1.34 ± 0.20 अणु, और कुल मिलाकर 2.51 ± 0.24 अणु।

पूरक नाप भी मौजूद हैं। कण-व्यास (डायनामिक लाइट स्कैटरिंग का z-औसत) pH 4.0 पर 106.3 ± 13.0 nm और pH 7.4 पर 120.5 ± 6.0 nm। ज़ीटा पोटेंशियल +45.1 ± 0.9 mV से −6.3 ± 1.3 mV तक। एनकैप्सुलेशन एफिशिएंसी RiboGreen से 94.2% ± 3.6%, और CICS की गिनती से निकालें तो 85.6% ± 5.1%।

इसके आगे लेखकों ने यह भी दिखाया कि 3-रंगी पहचान सचमुच ज़रूरी थी। YOYO-1 के बिना 2-रंगी पहचान करें तो अधिकतम 10.4% इवेंट “mRNA वाला LNP” के रूप में ग़लत पहचाने जाते हैं। यानी अतिरिक्त मेहनत का मतलब था।

② ख़ाली कण क्यों बढ़ते हैं — डायलिसिस के दौरान कण “टूटते हैं और आपस में जुड़ते हैं”

pH 4.0 पर ख़ाली LNP 41% थे, पर pH 7.4 पर 77%। यानी वे बढ़ गए। लेखकों ने इसमें कण-निर्माण की क्रियाविधि पढ़ ली।

कुंजी है यह पूर्व-ज्ञान कि PEG लिपिड “कण के आकार की ऊपरी सीमा” तय करता है। PEG अंतरापृष्ठ पर एक निश्चित क्षेत्रफल घेरता है, इसलिए बाक़ी लिपिड की मात्रा वही रहे तो PEG का अनुपात जितना बढ़ेगा, कण के पास पृष्ठ-क्षेत्रफल/आयतन अनुपात बढ़ाने यानी छोटा होने के सिवा चारा नहीं। सचमुच, DMG-PEG को 0.25% से 3% तक बढ़ाने पर pH 7.4 का औसत कण-व्यास 210 nm से 100 nm तक सिकुड़ गया। दूसरी ओर pH 4.0 पर PEG की मात्रा बदलने से न कण-व्यास बदलता है, न लदान। यानी सारा बदलाव डायलिसिस के दौरान हो रहा है।

👦 छात्र：डायलिसिस तो बस एथेनॉल निकालने का काम है न?

🧬 एक्सोतारो：यहीं गड्ढा है। डायलिसिस से pH 4.0 से 7.4 तक चढ़ता है, और आयनीकरणीय लिपिड अपना धनावेश खो देता है। pH 4.0 पर जो कण “आवेश के प्रतिकर्षण + PEG” से स्थिर था, उसे pH 7.4 पर “केवल PEG” के सहारे स्थिर रहना पड़ता है। सहारे का ढंग बदल जाता है, इसलिए कण अपनी शक्ल फिर से जमाता है। और इस मौक़े पर उसे pH 4.0 की द्विस्तरीय झिल्ली वाली पुटिका से pH 7.4 की उस संरचना में जाना पड़ता है जिसमें “एक परत जलविरोधी कोर को लपेटे रहती है”। उतने ही लिपिड से अधिक पृष्ठ-क्षेत्रफल चाहिए। इसलिए कण टूटते होंगे — यही पेपर का पढ़ा हुआ सूत्र है (चित्र 4 और चित्र 6 के कथानक के बारे में पेपर स्वयं “परिकल्पना (hypothesized)” लिखता है)।

पेपर जो कथानक पेश करता है, वह यह है। आगे जो कुछ है, वह सब आबादी-स्तर के सांख्यिकी से निकाले गए अनुमान के रूप में पेपर ने खड़ी की हुई परिकल्पना है, और टूटने या जुड़ने के क्षण का प्रत्यक्ष अवलोकन नहीं है।

PEG ज़्यादा होने पर (1.5% या उससे अधिक): ख़ाली LNP टूटकर बढ़े ऐसा माना जाता है (TMR का औसत गिरना और संख्या-सांद्रता चढ़ना — इन अवलोकित तथ्यों से)। शुरुआत में जिनका लदान अधिक था, उन लिपोफ़िलिक कॉम्प्लेक्सों का एक हिस्सा भी टूटा और उसका लदान घटा — यही व्याख्या दी गई है। मध्यम से कम लदान वाले अपना लदान बचा लेते हैं। PEG बहुत ही अधिक (3.0% या उससे ऊपर) हो तो टूटना हावी हो जाता है, औसत लदान गिरता है और कणों की संख्या बढ़ती है। दूसरी ओर, जिनके पास हेल्पर लिपिड नहीं था, उन गैर-लिपोफ़िलिक कॉम्प्लेक्सों ने ख़ाली LNP से जुड़कर हेल्पर लिपिड पा लिया — ऐसा अनुमान लगाया गया है (डायलिसिस के बाद लदान-वितरण का तुलनात्मक रूप से एक-जैसा हो जाना, और जिस आबादी के पास TMR नहीं था उसके TMR पा लेने — इन दोनों से उलटकर निकाला गया है)।

PEG कम होने पर (1.0% या उससे नीचे): आकार की ऊपरी सीमा ढीली पड़ जाती है, इसलिए लिपोफ़िलिक कॉम्प्लेक्स आपस में जुड़ सकते हैं — पेपर यही सोचता है। नतीजतन लदान बहुत बढ़ गया। इस स्थिति में TMR संकेत की बढ़त mRNA के लदान की बढ़त से लगातार अधिक रही — यह इसका सबूत है कि लिपिड ख़ाली LNP से लिया जा रहा है।

असली आँकड़ों की तुलना इसे साफ़ कर देती है। PEG 1.5% पर ख़ाली 41% → 77%, और PEG 0.5% पर ख़ाली 33% → 81%। दोनों में डायलिसिस के बाद ख़ाली कण बढ़े हैं।

③ N/P अनुपात घटाने पर, आकार वही रहकर लदान बढ़ता है

अगला नियंत्रित चर है N/P अनुपात। mRNA की सांद्रता स्थिर रखकर, आयनीकरणीय लिपिड के अनुपात में सभी लिपिड घटाए-बढ़ाए जाते हैं। PEG का “कुल लिपिड में अनुपात” नहीं बदलता, इसलिए कण के आकार की ऊपरी सीमा भी नहीं बदलती।

पर आकार वही रहते हुए भी, N/P अनुपात घटाने पर प्रति कण लदान बढ़ गया। तर्क स्टॉक के अनुपात का है। N/P अनुपात गिरना = लिपिड का mRNA की तुलना में अपेक्षाकृत कम हो जाना = ख़ाली LNP बन जाने वाले लिपिड का घट जाना। सचमुच, pH 4.0 पर ख़ाली LNP के अनुपात ने N/P अनुपात के साथ मज़बूत धनात्मक सहसंबंध दिखाया (N/P = 12 पर 50%, N/P = 2 पर 15%)।

इससे डायलिसिस के दौरान किससे मुलाक़ात होती है यह बदल जाता है — पेपर की व्याख्या यही है। N/P अनुपात ऊँचा हो तो चारों ओर ख़ाली LNP ही होते हैं, इसलिए mRNA वाला कण ख़ाली LNP से जुड़कर (यानी mRNA बढ़ाए बिना केवल लिपिड पाकर) ऊपरी आकार-सीमा तक पहुँच जाता है। N/P अनुपात नीचा हो तो चारों ओर mRNA कॉम्प्लेक्स होते हैं, इसलिए mRNA वाले कण आपस में जुड़ते हैं। ये दोनों ही अवलोकन नहीं, वितरण से निकाले गए कथानक हैं। एक ही ऊपरी आकार-सीमा तक पहुँचने में, लदे सामान की संख्या अलग-अलग निकल आती है।

पर pH 7.4 पर ख़ाली कणों का अनुपात, N/P अनुपात घटाने पर भी नहीं घटा। कम N/P अनुपात पर ख़ाली LNP की निरपेक्ष संख्या भी घटती है, लेकिन लदान बढ़ने के कारण mRNA वाले LNP की संख्या भी घट जाती है। दोनों एक-दूसरे को काट देते हैं, इसलिए अनुपात हिलता नहीं — यही व्याख्या है।

④ सांद्रता से फ़र्क़ नहीं पड़ता, आकार से पड़ता है — “लदान संख्या नहीं, वज़न है”

mRNA की सांद्रता 5 से 100 µg/mL तक 20 गुना बदलकर, लिपिड भी उसी अनुपात में बदला जाए, तो कण-व्यास और लदान-वितरण, दोनों में लगभग कोई बदलाव नहीं आया (केवल ख़ाली कणों का अनुपात सबसे कम सांद्रता 5 µg/mL पर सबसे नीचा रहा, और 20–100 µg/mL पर लगभग एक-जैसा)।

यह बहुलकों की दुनिया के आम ज्ञान से उलट है। pDNA और पॉलीएथिलीनइमीन के कॉम्प्लेक्स में यह जाना हुआ था कि न्यूक्लिक अम्ल की सांद्रता बढ़ाने पर अधिक लदान वाले कणों पर अवस्था गतिकीय रूप से जम जाती है। लेखकों की व्याख्या है कि कैटायनिक लिपिड बहुलक कैटायन से तेज़ चलता है, इसलिए वह mRNA तक पर्याप्त पहुँच बना लेता है और कई mRNA को आपस में जोड़ने (क्रॉसलिंक) की प्रवृत्ति कम रखता है।

उलटे, जिससे फ़र्क़ पड़ा वह थी mRNA की लंबाई। 1929 nt की जगह 996 nt (लगभग आधी) रख दें, तो आकार की ऊपरी सीमा नहीं बदलती, पर औसत लदान सार्थक रूप से बढ़ गया, और सबसे आम मान pH 4.0 तथा 7.4, दोनों पर 2 गुना हो गया। ख़ाली कणों का अनुपात भी N/P = 3 और N/P = 6, दोनों पर घटा।

🧬 एक्सोतारो：यहाँ से निकलने वाला एक वाक्य ही इस पेपर का सबसे सुंदर निष्कर्ष है। “किसी निश्चित आकार-सीमा वाले LNP की लदान-क्षमता mRNA की संख्या से नहीं, एक निश्चित द्रव्यमान के रूप में व्यक्त की जा सकती है”। जब ट्रॉली का आयतन तय है, तो सामान छोटा हो तो गिनती में ज़्यादा लद जाएगा। siRNA (लगभग 20 nt) लादने वाले अध्ययन में ख़ाली LNP मौजूद ही नहीं थे — ऐसी रिपोर्ट होना भी इसी तर्क से जुड़ जाता है।

⑤ ख़ाली कण मिला देने पर यकृत में अभिव्यक्ति घट गई

आख़िर में यह जाँचा जाता है कि यह बात शरीर के भीतर कोई अर्थ रखती है या नहीं। N/P = 3 और N/P = 6 के फ़ॉर्मुलेशन (पेपर के विवरण के अनुसार दोनों में ख़ाली कण लगभग 75% हैं। तालिका 2 के बेंचमार्क मान 77% ± 8% से यह थोड़ा हटता है, पर दोनों ही पेपर के अपने आँकड़े हैं) के अलावा, N/P = 3 पर बने LNP में ख़ाली LNP बाद में मिलाकर कुल N/P अनुपात 6 कर दिया गया — “N/P = 3+3” नाम का समूह (ख़ाली कण 86%) भी तैयार किया गया। यह वह समूह है जिसमें mRNA वाले LNP की संख्या बदले बिना, केवल ख़ाली कण लगभग 2 गुना किए गए हैं।

ल्यूसिफ़ेरेज़ mRNA लादकर Balb/cJ माउस (मादा, 8 सप्ताह की उम्र) की पूँछ की शिरा से 0.5 mg mRNA/kg दिया गया, 12 घंटे बाद D-ल्यूसिफ़ेरिन उदर-गुहा में देकर IVIS से चित्र लिए गए, और अंग निकालकर मात्रा नापी गई।

• यकृत: ख़ाली LNP मिलाए गए समूह (N/P = 3+3) में अभिव्यक्ति घट गई (P = 0.0298, अयुग्मित द्विपक्षीय t-परीक्षण, N/P = 3 और N/P = 3+3 की तुलना)। यकृत में वितरित मात्रा स्वयं नहीं बदली
• प्लीहा: N/P = 3 से बने 2 समूहों (3 और 3+3) ने ही अर्थपूर्ण अभिव्यक्ति दिखाई, और N/P = 6 पर लगभग कोई अभिव्यक्ति नहीं हुई (P = 0.0280)

यकृत में LNP के जमा होने की वजह रक्त में मौजूद अपोलिपोप्रोटीन E (ApoE) के साथ अंतःक्रिया मानी जाती है। लेखक यह संभावना उठाते हैं कि ख़ाली LNP ने mRNA वाले LNP से ApoE की छीना-झपटी की, पर साथ ही “और जाँच की ज़रूरत है” लिखकर सावधानी से बात समेट देते हैं।

भविष्य कैसे बदलेगा? (क्लिनिक तक का रास्ता)

उत्पादन की गुणवत्ता-जाँच में “कण की तरफ़ से देखा गया पैमाना” जोड़ा जा सकता है

सबसे व्यावहारिक इस्तेमाल यही है। CICS प्रवाह के भीतर नापता है, इसलिए नमूने की मात्रा बहुत थोड़ी चाहिए, और प्रति फ़ॉर्मुलेशन 20 मिनट में 50,000 से अधिक इवेंट निपटाए जा सकते हैं (इवेंट में नंगी mRNA जैसी दूसरी किस्में भी शामिल होती हैं)। पेपर ने इसे भंडारण-स्थिरता के आकलन पर भी लगाकर दिखाया (पूरक चित्र 12)।

आज LNP फ़ॉर्मुलेशन के लॉट की जाँच में कण-व्यास, पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स, ज़ीटा पोटेंशियल और एनकैप्सुलेशन एफिशिएंसी इस्तेमाल होते हैं। वहाँ “ख़ाली-कण दर” और “प्रति कण लदान-वितरण” भी जुड़ जाएँ तो क्या होगा? एनकैप्सुलेशन एफिशिएंसी एक-सी 94% होने पर भी, जिस लॉट में ख़ाली-कण दर 77% है और जिसमें 50% है, उनमें एक ही mRNA मात्रा देने पर ढोया जाने वाला कुल लिपिड अलग होता है। यानी एक ही असर पैदा करने के लिए पड़ने वाले लिपिड-बोझ को एक पैमाने के रूप में संभाला जा सकेगा।

“ख़ाली कण घटाओ” — अनुकूलन की यह दिशा दिख गई

इस पेपर ने यह क्रम से रख दिया कि कौन-सी घुंडी घुमाने पर क्या हिलता है। PEG की मात्रा कण के आकार की ऊपरी सीमा तय करती है; लिपिड और mRNA का द्रव्यमान-अनुपात यह तय करता है कि “शुरू में बनने वाले mRNA कॉम्प्लेक्स और ख़ाली LNP के बीच बाँट” कैसी होगी; और डायलिसिस के दौरान का टूटना-जुड़ना उसे अंतिम शक्ल देता है। सांद्रता से कोई फ़र्क़ नहीं पड़ता। कार्गो छोटा हो तो ख़ाली कण घटते हैं।

👦 छात्र：तो फिर ख़ाली कण शून्य वाला LNP बना लें?

🧬 एक्सोतारो：मज़ा इसी में है कि बात इतनी सरल नहीं। ख़ाली कण घटाने के लिए N/P अनुपात गिराएँ, तो प्रति कण लदान बढ़ जाता है और कणों की संख्या घट जाती है। इस पेपर के जंतु-प्रयोग में N/P = 6 ने प्लीहा में लगभग कोई अभिव्यक्ति नहीं दी, और N/P = 3 ने दी। अधिक लदान वाले थोड़े कण, और कम लदान वाले बहुत कण — कुल mRNA मात्रा एक ही हो तब भी शरीर के भीतर इनका बरताव अलग होता है। कहाँ पहुँचाना है, इससे सर्वोत्तम हल बदल जाता है। ख़ाली-कण दर को “घटाने लायक़ बुराई” नहीं, बल्कि डिज़ाइन की आज़ादी का एक आयाम मानकर पढ़ना चाहिए।

दूसरी ओर, क्लिनिक तक की दूरी साफ़-साफ़ बड़ी है

इस पेपर में क्लिनिकल आँकड़े नहीं हैं। माउस का प्रयोग भी एक बार की ख़ुराक, 12 घंटे का एक ही समय-बिंदु, केवल यकृत और प्लीहा, और रिपोर्टर जीन तक सीमित है। बार-बार की ख़ुराक, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, चिकित्सकीय प्रोटीन की अभिव्यक्ति, और मनुष्य में औषध-गतिकी — ये सब दायरे से बाहर हैं। और जैसा अगले खंड में लिखूँगा, जो फ़ॉर्मुलेशन नापा गया वह आज चल रही वैक्सीन का फ़ॉर्मुलेशन नहीं है।

इस शोध को आलोचनात्मक ढंग से कैसे पढ़ें (सीमाएँ, और गुणवत्ता और बढ़ाने के रास्ते)

जो बातें सराहने योग्य हैं

निष्पक्ष लिखता हूँ। माप का डिज़ाइन सही है। प्रकाश की चादर से अनुप्रस्थ काट ढककर संसूचन-दक्षता एक-जैसी कर देने की सोच, 3 रंगों के एक साथ जलने से 3 किस्मों की पहचान का डिज़ाइन, और नंगी mRNA के 1 अणु का वितरण प्रत्यक्ष नापकर उसे आधार बनाना — ये सभी “बिना धोखे की गिनती” की दिशा में जाते हैं। डायलिसिस के पहले और बाद, दोनों नापने से स्थिर विवरण क्रियाविधि की बात बन गया। 2 रंगों से अधिकतम 10.4% ग़लत पहचाने जा सकते हैं, यह उन्होंने ख़ुद मात्रा में नापा — यह भी ईमानदारी है। लंबवत (orthogonal) विधि से पुष्टि की गई है — अति-विभेदन सहसंकेंद्री माइक्रोस्कोप से रेज़िन में जमाए गए LNP देखकर, एक अलग रास्ते से यह पक्का किया गया कि ख़ाली कण अधिक हैं। और कोड माँगने पर दिया जाएगा, तथा स्रोत-डेटा भी नत्थी है। पुनरुत्पादकता के प्रति रवैया अच्छा है।

जिन बातों का ध्यान रखकर पढ़ना चाहिए

① यह आज चल रही mRNA वैक्सीन की माप नहीं है। यही बिंदु सबसे ज़्यादा ग़लत समझा जाता है, इसलिए इसे पहले रख रहा हूँ। जो आयनीकरणीय लिपिड इस्तेमाल हुआ वह DLin-MC3-DMA है (वही लिपिड जो siRNA दवा पैटिसिरन में व्यवहार में आया), न कि नए कोरोना वायरस की वैक्सीन वाला ALC-0315 (BNT162b2) या SM-102 (mRNA-1273)। mRNA भी यूरिडीन का 25% Cy5-चिह्नित रूप से बदली गई बाज़ार में मिलने वाली रंजक-चिह्नित mRNA है, जो वैक्सीन में इस्तेमाल होने वाली N1-मेथिलप्स्यूडोयूरिडीन-रूपांतरित mRNA से अलग चीज़ है। डायलिसिस भी प्रयोगशाला-पैमाने की 12 घंटे की बैच है, जो औद्योगिक स्पर्शरेखीय-प्रवाह निस्यंदन (tangential flow filtration) से भिन्न है। “वैक्सीन के 80% कण ख़ाली थे” — ऐसा सार निकालना इस पेपर को पढ़ने का ग़लत तरीक़ा है।

② प्रतिदीप्ति के रैखिक होने की कोई गारंटी नहीं दिखाई गई है। डीकॉन्वोल्यूशन पूरी तरह इस मान्यता पर टिका है कि “n अणु वाले कण की चमक, 1 अणु के वितरण की n गुना होती है”। पर रंजक घनी भीड़ में हो तो स्व-शमन (self-quenching) करता है, और दूरी कम हो तो ऊर्जा-स्थानांतरण भी होता है। कई mRNA लिपिड के कोर में ठुँसी हुई हों, तब भी Cy5 सचमुच n गुना चमकता है या नहीं — पेपर ने इसकी जाँच नहीं की। शमन हो रहा हो तो लदान का कम आकलन होगा। ज्ञात मात्रा की mRNA भरे हुए कंट्रोल, या शमन है या नहीं यह जाँचने वाला कोई प्रयोग होता, तो यह मान्यता काफ़ी मज़बूत हो जाती।

③ कण-संख्या सांद्रता की इकाई मेल नहीं खाती। तालिका 2 में mRNA वाले LNP की संख्या-सांद्रता 1.29 × 10¹⁶ ± 2.22 × 10¹⁵ mL⁻¹ लिखी है। पर डाली गई mRNA की मात्रा से आकलन करें तो mRNA 20 µg/mL और 1929 nt (आण्विक भार लगभग 6.4 × 10⁵) का अर्थ है लगभग 1.9 × 10¹³ अणु/mL, और एनकैप्सुलेशन एफिशिएंसी 85.6% तथा प्रति कण 2.80 अणु मानें तो लगभग 6 × 10¹² कण/mL। दर्ज मान इससे लगभग 2,000 गुना बड़ा है। मान लें कि इकाई L⁻¹ होनी चाहिए थी, तब भी लगभग 2.2 गुना का अंतर बचा रह जाता है, इसलिए यह भी पक्का नहीं कहा जा सकता कि इकाई ग़लती से लिखी गई है। गणना का ब्यौरा पूरक सामग्री (Supplementary Discussion 2–5) में है और मुख्य पाठ से उसका पीछा नहीं किया जा सकता, इसलिए मैं ठोककर कुछ नहीं कह रहा; पर केवल मुख्य पाठ पढ़कर आँकड़ा उद्धृत करें तो घात (order) ग़लत हो जाएगी। हाँ, ख़ाली और mRNA वाले कणों का अनुपात (4.88 × 10¹⁶ बनाम 1.29 × 10¹⁶ ≈ 79% बनाम 21%) 77%/23% के अनुकूल बैठता है, इसलिए अनुपात के तौर पर पढ़ने भर में कोई दिक़्क़त नहीं है।

④ मुख्य पाठ में एक परस्पर-विरोधी वाक्य है। 3-रंगी पहचान ज़रूरी है, यह सिद्ध करने के ठीक बाद लिखा है: “इसलिए, लदान के वितरण और क्षमता की गणना में अधिक परिशुद्धता पाने के लिए 2-रंगी पहचान-विधि का प्रयोग किया गया”। संदर्भ से इसे “3-रंगी पहचान का प्रयोग किया गया” की ग़लत छपाई मानकर पढ़ना स्वाभाविक है, पर मुख्य परिणाम किस विधि से निकले, यह मुख्य पाठ से तय नहीं हो पाता — गिनती को अपनी ख़ासियत बताने वाले पेपर के लिए यह चुभता है। इसी तरह लेज़र की तरंगदैर्घ्य परिणाम-खंड में 647 nm और विधि-खंड में 640 nm बताई गई है, जो आपस में टकराती है (उत्पाद के नाम से देखें तो 640 nm सही है)। चित्र 7 का विवरण भी यकृत के परिणाम को “पैनल i” कहकर इंगित करता है, जबकि वह असल में पैनल l है। इनमें से कोई भी निष्कर्ष को नहीं पलटता, पर ये प्रूफ़-रीडिंग से मिट जाने वाली ख़ामियाँ थीं।

⑤ “डायलिसिस से पहले” वाली संज्ञा विधि-खंड से टकराती है। ऊपर छुए गए बिंदु को सीमा के रूप में फिर से गिना रहा हूँ। तालिका 2 pH 4.0 के नमूने को “डायलिसिस से पहले (= शुरुआती LNP)” कहती है, पर विधि का खंड स्पष्ट लिखता है कि pH 4.0 का नमूना भी 12 घंटे डायलिसिस किया गया (एसिटिक बफ़र के विरुद्ध, एथेनॉल हटाने के लिए)। तुलना “डायलिसिस हुई या नहीं” की नहीं, बल्कि “डायलिसिस किस pH तक की गई” की है। पेपर का दावा — pH चढ़ने पर डीप्रोटोनेशन होता है और कण फिर से जमता है — इस सुधार के बाद भी नहीं डगमगाता, पर “डायलिसिस से पहले” शब्द को अक्षरशः ले लें तो यह भ्रम होगा कि एथेनॉल बचे रहने की अवस्था वाले कण नापे गए। तालिका और विधि-खंड में शब्द एक-जैसे रखने चाहिए थे।

⑥ “क्रियाविधि” लगभग पूरी तरह परिकल्पना है। चित्र 4 और चित्र 6 का टूटने-जुड़ने वाला कथानक, जैसा पेपर स्वयं hypothesized और presumably लिखता है, आबादी-स्तर के सांख्यिकी (अनुपात, TMR का गुणोत्तर माध्य, संख्या-सांद्रता) से निकाला गया अनुमान है। एक-एक कण के टूटने/जुड़ने के क्षण को समय-विभेदन के साथ देखा नहीं गया है। पूर्व के FRET तथा क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की रिपोर्टों से यह मेल खाता है, इतना समर्थन तो है, पर “ऐसा ही होना चाहिए” और “ऐसा ही है” के बीच की दूरी बाक़ी रह जाती है।

⑦ n छोटा है, इसलिए नकारात्मक निष्कर्ष कमज़ोर हैं। लगभग सभी स्थितियों में n = 3 है (केवल बेंचमार्क में n = 6)। “सांद्रता लदान को प्रभावित नहीं करती”, “mRNA का आकार ऊपरी आकार-सीमा को प्रभावित नहीं करता” — ऐसे अंतर न होने के दावे n = 3 पर करने हों, तो समतुल्यता दिखाने वाला डिज़ाइन और सांख्यिकीय शक्ति का विवरण चाहिए।

⑧ एनकैप्सुलेशन एफिशिएंसी के 2 मानों के बीच की खाई भरी नहीं गई है। RiboGreen से 94.2% और CICS से 85.6% — इन दोनों के बीच लगभग 9 पॉइंट के अंतर को पेपर साथ-साथ रख देने भर से आगे नहीं जाता, कारण पर चर्चा नहीं करता। कौन-सा सच के अधिक निकट है, और अंतर संसूचन-दक्षता से आया है या रंजक की पहुँच से — ये बातें गिनती की विश्वसनीयता से ही जुड़ी हैं।

⑨ जंतु-प्रयोग की व्याख्या में सहकारी-कारक (confounding) है। N/P = 3+3 समूह वह है जिसमें ख़ाली LNP मिलाए गए थे। यानी दी गई लिपिड की कुल मात्रा भी बढ़ी हुई है। यकृत में अभिव्यक्ति के घटने को ApoE की छीना-झपटी से समझाना हो, तो कुल लिपिड मात्रा बराबर रखा गया कंट्रोल चाहिए (उदाहरण के लिए, ख़ाली LNP की जगह उतनी ही मात्रा में असंबंधित लाइपोसोम मिलाने वाला समूह)। लेखक ठोककर दावा करने से बचते हैं, यह उचित है, पर “ख़ाली कण अड़चन डालते हैं” वाला पाठ केवल इस आँकड़े से तय नहीं होता। इसके अलावा n = 3–4, 12 घंटे का एक ही समय-बिंदु, केवल मादा, और केवल 1 वंश-क्रम है।

⑩ जो नापा जा रहा है वह “तनुकरण के बाद, 1 घंटे से अधिक रखे जाने के बाद” की अवस्था है। CICS में नमूना तनु करके YOYO-1 के साथ अंधेरे में 1 घंटे से अधिक इंक्यूबेट किया जाता है, और फिर 20 मिनट लगाकर नापा जाता है। LNP कोई साम्यावस्था में टिका कड़ा ढाँचा नहीं है, इसलिए माप की पूर्व-प्रक्रिया के दौरान अवस्था हिल नहीं रही थी या नहीं — यह असल में जाँचने लायक़ बिंदु है (भंडारण-स्थिरता नापकर दिखाना एक अच्छा संकेत है, पर वह पूर्व-प्रक्रिया की ही जाँच नहीं है)।

⑪ लदान और कार्य के बीच की कड़ी जुड़ी नहीं है। “प्रति कण कितने अणु” पता चल जाने पर भी, यह एंडोसोम से निकल भागने या अनुवाद की मात्रा से कैसे जुड़ता है — यह नापा नहीं गया। 2 अणु लादे कण और 8 अणु लादे कण में, एक कण कोशिका के भीतर जाने पर प्रोटीन का उत्पादन कितने गुना अलग होता है? वह खाई भरने के बाद ही ख़ाली-कण दर एक डिज़ाइन-पैमाने के रूप में पूरी होगी।

यह शोध और भी बेहतर कैसे हो सकता था

• शमन की जाँच शामिल करें। ज्ञात कॉपी-संख्या वाली mRNA भरे मानक कण, या Cy5-चिह्नन की दर बदली हुई mRNA से रैखिकता की पुष्टि करें। डीकॉन्वोल्यूशन की बुनियाद पक्की हो जाएगी
• आज चल रही वैक्सीन के फ़ॉर्मुलेशन (ALC-0315, SM-102) पर वही माप करें। यही इस शोध का सबसे बड़ा बहिर्वेशन-लक्ष्य है, और पाठक सबसे पहले यही आँकड़ा जानना चाहता है
• संख्याओं और इकाइयों को यंत्रवत् आमने-सामने मिलाएँ। कण-संख्या सांद्रता की इकाई, 2-रंगी/3-रंगी का विवरण, लेज़र की तरंगदैर्घ्य, और चित्रों के संदर्भ — ये सब सबमिशन से पहले की एक चेकलिस्ट से मिट सकते थे
• क्रियाविधि को सीधे देखें। स्टॉप्ड-फ़्लो + समय-विभेदित FRET से, या डायलिसिस की प्रक्रिया का पीछा कर सकने वाले माइक्रोफ्लुइडिक चैनल से, टूटना और जुड़ना वास्तविक समय में पकड़ें
• जंतु-प्रयोग में कुल लिपिड मात्रा बराबर रखें। ख़ाली LNP के असर का दावा करना हो तो लिपिड की मात्रा मिलाया हुआ कंट्रोल समूह चाहिए। ख़ुराक के बाद का समय-क्रम और कई अंग भी
• लदान और अभिव्यक्ति को एक-कोशिका स्तर पर जोड़ें। लदान एक-जैसा किए हुए कण अलग-अलग बनाकर, अंतर्ग्रहण की संख्या और प्रोटीन का उत्पादन साथ-साथ नापें

एक्सोतारो का नज़रिया

संगत लेखक, मेरी ही बीमारी पर शोध कर रहे हैं

ईमानदारी से कहूँ। mRNA-LNP का फ़ॉर्मुलेशन-भौतिक रसायन ठीक मेरी विशेषज्ञता नहीं है। मैं जिस काम में लगा हूँ, वह है मेसेनकाइमल स्टेम सेल (mesenchymal stem cell, MSC) और उससे निकलने वाली बाह्यकोशिकीय पुटिका (extracellular vesicle, EV) के सहारे, रीढ़ की हड्डी की चोट जैसे तंत्रिका-रोगों का इलाज।

फिर भी यह पेपर चुनने की एक वजह यह थी कि संगत लेखक Mao की प्रयोगशाला रीढ़ की हड्डी की चोट की पुनर्योजी चिकित्सा असल में कर रही है। जैसा पहले कहा, Biomaterials 2020 में रैट के रीढ़-कुचलन में नैनोफ़ाइबर-हाइड्रोजेल कंपोज़िट का इंजेक्शन, और Cells 2022 में MSC को उसी कंपोज़िट के साथ जोड़कर किया गया रीढ़-चोट का इलाज। नैनोकणों को एक-एक गिनने वाला शोध, और MSC को क्षतिग्रस्त रीढ़ तक पहुँचाने वाला शोध, एक ही छत के नीचे हैं। मुझे नहीं लगता कि यह संयोग है। दोनों ही “वाहक के भीतर क्या है, यह हम कहाँ तक जानते हैं” इस एक ही सवाल के दो सिरे हैं।

सबसे भारी सबक़ — हम औसत की भाषा में बहुत ज़्यादा बोलते हैं

इस पेपर ने मेरे सामने जो रखा, वह न विधि थी न आँकड़े, बल्कि सवाल खड़ा करने का ढंग था।

EV के पेपरों में हम जो आँकड़े लिखते हैं, उन्हें याद कीजिए। नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण से “प्रति 1 mL कितने कण”। किसी दूसरी परखनली में RNA निकालकर “कितने ng RNA” या “यह miRNA कितनी कॉपी”। और फिर भाग देकर कह देते हैं “प्रति कण कितनी कॉपी”।

यह ठीक वही “बल्क औसत लदान” है जिसके बारे में इस पेपर ने दिखाया कि “औसत से पता नहीं चलता”। आबादी की कुल मात्रा को आबादी की गिनती से भाग देकर निकाला गया औसत। “किस कण में कितने अणु हैं” — इसका यह उत्तर नहीं देता। (एहतियातन — यह एनकैप्सुलेशन एफिशिएंसी से अलग चीज़ है। एनकैप्सुलेशन एफिशिएंसी तो “डाली गई mRNA में से कितना हिस्सा लिपटा” वाला mRNA की तरफ़ का अनुपात है, भाग देकर प्रति कण अणुओं की संख्या निकाली गई चीज़ नहीं। इस पेपर ने जो ढहाया वह “औसत की भाषा में बोलना” है।)

EV के क्षेत्र में चेतावनी पहले से मौजूद थी। Chevillet और साथियों ने PNAS 2014, खंड 111, अंक 41, पृष्ठ 14888 पर एक्सोसोम की miRNA-मात्रा का मात्रात्मक एवं स्टॉइकियोमीट्रिक विश्लेषण करके यह रिपोर्ट किया कि अलग-अलग एक्सोसोमों में से ज़्यादातर, जैविक रूप से अर्थपूर्ण संख्या में miRNA नहीं ढोते। जिन विशिष्ट miRNA का प्रति कण औसत 0.01 कॉपी से भी नीचे बैठता है, उनके बारे में “औसत 0.01 कॉपी” का अर्थ यह नहीं है कि “हर कण में 0.01 कॉपी है”, बल्कि यह है कि “ज़्यादातर कण ख़ाली हाथ हैं, और बहुत थोड़े कणों के पास ही 1 या अधिक कॉपी है” (केवल औसत से वितरण की शक्ल तय नहीं होती, इसलिए “100 कणों में से 1 कण के पास ठीक 1 कॉपी है” — ऐसा ठोककर नहीं कहा जा सकता)। LNP में 77% ख़ाली होने वाली बात से इसकी बनावट एक ही है।

अपनी ही आत्म-समीक्षा के तौर पर लिखता हूँ। MSC-EV के चिकित्सकीय असर को किसी विशिष्ट miRNA के खाते में डालते समय, वह miRNA असल में जिन कणों के पास है, वे कुल कणों के कितने % हैं — यह मैंने नापा नहीं है। इस पेपर के लेखकों ने जो संश्लेषित कणों पर किया, वह हम जैविक मूल के कणों पर अभी तक नहीं कर पाए हैं।

पर आँकड़े उठाकर नहीं रखे जा सकते — जो उठाया जा सकता है वह सिर्फ़ सवाल है

यहाँ सावधानी से लिखता हूँ। LNP और EV अलग चीज़ें हैं। LNP एक संश्लेषित कण है जिसे डिज़ाइन करके जोड़ा जाता है; उसकी संरचना ज्ञात होती है और आकार-वितरण भी नियंत्रित किया जा सकता है। EV जीव बनाते हैं, इसलिए हर कण दूसरे से अलग होता है, उसकी झिल्ली में टेट्रास्पैनिन जैसी झिल्ली-प्रोटीनें धँसी होती हैं, और सतह प्रोटीन की एक परत से ढकी रहती है। “77% ख़ाली” वाला आँकड़ा EV पर लागू होने का कोई आधार कहीं नहीं है।

जो उठाया जा सकता है वह है सवाल और कार्यप्रणाली। और सच कहें तो कार्यप्रणाली की तरफ़ से दूरी अप्रत्याशित रूप से कम है। CICS वह तकनीक है जिसमें “केशनली में एक कतार में बहाकर, कई रंगों के एक साथ जलने से वर्गीकरण किया जाता है, और ज्ञात एकल-अणु वितरण को आधार बनाकर संख्या का आकलन किया जाता है”। EV के क्षेत्र में अभी फैलते जा रहे एकल-पुटिका विश्लेषण (single-EV analysis) और प्रवाह-मार्ग का इस्तेमाल करने वाली उच्च-संवेदनशीलता फ्लो साइटोमेट्री, उसी सोच की उसी दिशा में हैं।

👦 छात्र：तो फिर EV पर भी वही कर लेना चाहिए न?

🧬 एक्सोतारो：करना चाहिए, और करना भी चाहता हूँ। पर इस पेपर से सीखी एक आत्म-चेतावनी साथ जोड़ देता हूँ। इस पेपर ने जो सबसे दमदार दावा कर सका, वह इसलिए कर सका कि उसने डायलिसिस के पहले और बाद, दोनों नापे। अगर उसने केवल तैयार माल नापा होता, तो बात “80% ख़ाली हैं” इस तथ्य पर ही ख़त्म हो जाती और “ऐसा क्यों होता है” तक न पहुँचती। EV में भी वही है: संवर्धन-माध्यम के ऊपरी द्रव से इकट्ठा किए गए तैयार माल को ही नापते रहें, तो वितरण की यह शक्ल क्यों बनी, यह जीवन भर पता नहीं चलेगा। कोशिका EV में लादने का चरण, छोड़ने का चरण, इकट्ठा करने और शुद्ध करने का चरण — कहाँ क्या तय होता है, यह प्रक्रिया-दर-प्रक्रिया नापना ज़रूरी है। हम अभी लगभग केवल तैयार माल ही नाप रहे हैं।

पहुँचाने की जगह तक की दूरी अभी भरी नहीं है

आख़िर में, अपनी चुनौती के तौर पर। इस पेपर के जंतु-प्रयोग ने यकृत और प्लीहा तक पहुँचाना दिखाया है। शिरा में इंजेक्ट किया गया नैनोकण सबसे आसानी से जिन अंगों तक पहुँचता है वे ही ये हैं, और उसके ऊपर यह ApoE नाम के एक ज्ञात तंत्र पर सवार है। दूसरी ओर मैं जहाँ पहुँचाना चाहता हूँ, वह है रक्त-मस्तिष्क अवरोध और रक्त-मेरुरज्जु अवरोध के उस पार पड़ा क्षतिग्रस्त तंत्रिका-ऊतक।

कण के भीतर का सामान सही-सही गिन सकना, और उस कण का पहुँच जाना — ये दो अलग समस्याएँ हैं। फिर भी क्रम की बात यह है कि जो गिना न जा सके, उसका अनुकूलन नहीं हो सकता। “प्रति कण 2 अणु” यह आँकड़ा सामने आने से ही, “तो फिर कितने कण चाहिए”, “कितना लिपिड कंधे पर लादना पड़ेगा” — ये चर्चाएँ अनुमान की जगह गणना बन पाईं।

और मैं इस पेपर के लिखने के ढंग पर ही भरोसा करता हूँ। अपनी क्रियाविधि की व्याख्या के साथ “hypothesized” और “presumably” लिखा है, और जंतु-प्रयोग की व्याख्या के साथ “और जाँच की ज़रूरत है” लिखा है। जो नापा उसे और जो अनुमान लगाया उसे मिलाते नहीं। यह भड़कीला नहीं है, पर गिनती बेचने वाले पेपर के लिए यही रवैया उचित लगता है।

वैसे यह लेख उसी दिन प्रकाशित “mRNA वैक्सीन का ‘बढ़ाने वाला’ भीतर का सामान नहीं, डिब्बा ही था” के साथ जोड़ी बनाता है। यह वाला “LNP में से ज़्यादातर ख़ाली हैं” की बात है, और वह वाला “वही ख़ाली कण ही सहज प्रतिरक्षा जगाते हैं” की बात। दोनों साथ पढ़ने पर एक पायदान और मज़ा आता है।

नोट: यह लेख AI की सहायता से लिखा गया है।